通过2 -△△CT 方法,利用实时定量PCR技术分析相对基因表达差异
简述:
用实时 PCR 对基因表达进行相对定量分析需要特殊的公式、假设以及对这些假设的验证。 2 - △△ CT 方法可用于定量 PCR 实验来计算基因表达的相对变化: 2 - △△ CT 公式的推导 , 以及实验设计,有效性评估在 Applied Biosystems User Bulletin No.2(P/N4303859) 中有介绍。用 2 - △△ CT 方法分析基因表达数据在文献中也有报道 (5, 6) 。本文介绍了该方法的推导、假设以及应用。另外,本文还介绍了 2 - △△ CT 两种衍生方法的推导和应用,它们在实时定量 PCR 数据分析中都可能被用到。
PCR 指数扩增的公式是:
·Xn 是第 n 个循环後目标分子数。
·X0 是初始目标分子数。
·Ex 是目标分子扩增效率。
·n 是循环数
·C T 代表目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数
因此:
·X T 是目标分子达到设定的阈值时的分子数。
·C T,X 是目标分子扩增达到阈值时的循环数。
·Kx 是一个常数
对于内参反应而言,也有同样的公式:
用 X T 除以 R T 得到:
对于使用 Taqman 探针的实时扩增而言, X T 和 R T 的值由一系列因素决定:包括探针所带的荧光报导基团、探针序列对探针荧光特性的影响、探针的水解效率和纯度以及荧光阈值的设定。因此常数 K 并不一定等于 1 。
假设目标序列与内参序列扩增效率相同:
或:
X N 代表经过均一化处理过的初始目标分子量; △ C T 表示目标基因和内标基因 C T 值的差异( C T,X -C T,R ) 整理上式得:
最後用任一样本 q 的 X N 除以参照因子( calibrator , cb )的 X N 得到:
在这里
对于一个少于 150bp 的扩增片断而言,如果 Mg 2+ 浓度、引物都进行了适当的优化,扩增效率接近于 1 。因此目标序列的量通过内均一化处理之後相对于参照因子而言就是
2-△△ CT 方法的假设和应用