ClonePixTM 2系统提供了一种全新、快速评估哺乳细胞系GPCR靶蛋白表达水平的方法 1. 用哺乳表达系统快速评估GPCR靶蛋白的內源表达水平 2. 增加发现最优细胞反应器的可能性 3. 减少细胞系/抗体开发的时间—避免有限稀释法 背景 哺乳细胞GPCRs的内源表达通常是非常低的，一般不超过3,000拷贝/细胞。这些内源表达水平足够维护正常的受体功能，但在GPCR药物发现的应用存在挑战。大部分的筛选试验要求更高浓度的功能GPCRs呈现在细胞表面。例如，结构的研究，小分子药物设计和天然GPCR的功能抗体生产均需要GPCR表达水平是内源表达水平的几个数量级。在“低等”生物中尝试建立表达系统取得的成功非常有限，由于细菌的无效折叠；酵母的低产和杆状病毒不正确的翻译后修饰。这些挑战激发了药物发现应用中高表达GPCR蛋白哺乳细胞系的市场需求。 关于细胞系的开发，从转染细胞库中发现和筛选高表达GPCR克隆是非常有挑战的。ClonePix技术是已被证明的，一步法快速筛选大量异源细胞（3周10,000个克隆）。由于极其大容量的细胞库能够被筛选，大大增加了发现最优细胞生产器的可能性。利用白光和荧光的原位成像技术，ClonePix 2系统具有足够的灵敏性能够检测细胞表面有限表达的内源性蛋白。 方法 表达内源G蛋白偶联毒草碱1胆碱受体（GPCR-M1）的转染细胞系CHO-M1被选择来演示ClonePix2系统检测细胞表面表达蛋白的可行性。CHO-M1表达克隆用PE标记的抗-M1的抗体来筛选，ClonePix2基于荧光强度选择和挑选细胞。野生型的CHO-K1细胞系作为阴性对照。客观评价细胞生长及无标记技术的CloneSelect Imager系统，用来监控ClonePix2系统挑选细胞的增殖。FLIPR Tetra高通量细胞筛选系统和FLIPR Calcium 6试剂盒用来验证ClonePix2系统分离细胞克隆的功能。 FLIPR Tetra系统使用钙敏感荧光报告染料进行高通量功能细胞测定，是药物发现研究中评估GPCR激活引起的胞内钙反应的首选工具。 材料
1. 细胞系：CHO-M1细胞系，表达内源G蛋白偶联毒草碱1胆碱受体（ATCC,M1 WT3-CRL1985）. 亲本CHO-K1细胞用作阴性对照。
2. 抗体：兔抗ChRM1-PE标记，多抗（Bioss，Cat.#ABIN668656）; 兔抗-CHRM1 多抗，无标记；（Bioss，Cat.#bs-1150R）; 山羊抗兔IgG-PE标记，多抗（Life Technologies, Cat.#P2771MP）。
3. 培养基：Ham’s F12培养基（Corning cellgro, Cat.#10-080-CV）；CloneMedia-CHO-S (Molecular Devices,Cat. #K8710); Fetal Bovine Serum (Hyclone, Cat.#SH30071.03), 1% Pen/Strep/Glutamine (Life Technologies,Cat. #10378016), 450 μg/mL Geneticin, G418 (LifeTechnologies, Cat. #10131035)。
4. 反应缓冲液：10X HBSS (Life Technologies, Cat.#14065056) 无菌水稀释，注射用。(Irvine Scientific, Cat. #9309)，20 mM HEPES (Life Technologies, Cat. #15630080). pH 调整到7.4。
5. FLIPR® Calcium 6 Assay Kits (Molecular Devices, Cat.#R8190)。
6. 微孔板: 6-well non-TC treated, clear-bottom plates (Greiner Bio-One, Cat. #657185); 384-well black-wall, sterile,TC-treated, clear-bottom plates (Corning, Cat. #3072)。
7. M1 AChR agonist: Carbamoylcholine chloride or Carbachol(Sigma, Cat. #C4382)。
仪器概述 ClonePix 2 系统 1. 筛选和挑取哺乳细胞克隆的自动化系统 2. 白光和荧光成像 3. 透射光支持低对比度克隆如单层贴壁细胞成像 4. 软件控制5对激发/发射滤光片的切换 5. 用户自定义标准进行克隆排序 6. 目标克隆识别和挑取到96孔目标板 7. 支持悬浮和贴壁细胞的多种应用 1. 筛选和挑取分泌抗原特异性抗体的杂交瘤细胞 2. 细胞系开发 CloneSelect Imager 1. 无标记的白光细胞成像技术 2. 客观、定量评价细胞生长 3. 简单、容易使用的软件界面 4. 准确获取96孔板每个孔细胞的生长率 5. 支持多种应用： 1. 监控细胞生长 2. 单克隆验证 FLIPR Tetra 系统 1. 标准EMCCD荧光检测或可选ICCD荧光和化学发光检测 2. 用户可配置96-、384-、和1536孔板 3. 用户可更换的悬浮细胞选项 4. 独特的，可配置激发光学拓展了荧光种类的应用 5. 直观、容易使用的软件界面 半固体培养基培养细胞 CHO-M1和CHO-K1细胞系：CHO-M1和亲本CHO-K1细胞种在CloneMedia CHO（K8710）培养基中，每孔1000个细胞，37℃培养8-10天直到离散克隆形成。新传代的细胞和前几代的细胞分别种在培养基中，观察M1 GPCR的不同表达水平。 直接标记的方法：PE标记的CHRM1抗体随细胞直接加到半固体培养基中。对照孔包括细胞但是没有抗体。 双抗体方法：直接标记的方法没有效果的时候，用一抗和二抗测试可行性。非标记的rabbit anti-muscarinic抗体和PE标记的抗兔多克隆二抗随细胞直接加到半固体培养基中。对照孔包含细胞但没有抗体，连同仅仅含有二抗的对照孔。
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