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兔膀胱平滑肌细胞培养可以:(1)分离得到高纯度兔膀胱平滑肌细胞;(2)进行细胞学鉴定研究;(3)用于细胞学其他研究。
酶分离法
雄性新西兰白兔
DMEM Ⅱ型胶原酶 α-平滑肌肌动蛋白抗体 胎牛血清 胰蛋白酶 D-Hanks’液
饭盒 眼科直剪 眼科弯剪 眼科直镊 眼科弯镊 玻璃培养皿 广口瓶 烧杯 锥形瓶 离心管 磁力搅拌器 搅拌子 目尼龙筛网 针式滤器
一、实验方法 1. 膀胱平滑肌细胞酶法分离
(1)肌注盐酸氯胺酮200 mg 及氟哌利多5 mg 麻醉,待兔进入麻醉状态后消毒,下腹正中切口,迅速切取膀胱组织。
(2)超净台内依次庆大霉素溶液(浓度为100 单位/毫升)、生理盐水及D-Hanks’液中浸泡洗涤 5 分钟,然后放入D-Hanks液中除去黏膜、黏膜下及浆膜层。
(3)肌肉剪成肉糜后0.1%Ⅱ型胶原酶(2 mg/mL) 溶液 40 过夜消化(约10-12 小时)。
(4)然后加 0.25%胰蛋白酶 370 消化30 分钟,消化液变混浊呈絮状提示消化良好。
(5)用100 目细胞筛过滤该絮状液,混悬液离心(1000 转/分,离心半径 13 cm) 5 分钟,沉淀的细胞移入培养皿,加入含 10%胎牛血清的DMEM,置于50 mL/L CO2、37℃饱和湿度孵育箱中静置培养, 培养液每周更换 2-3 次。
2. 传代培养
(1)待培养的细胞通过增殖达到约 80%汇合状态时做传代处理。
(2)弃去原培养瓶中的旧培养液,加入适量 的PBS(因培养液中的胎牛血清对胰蛋白酶有抑制作用),轻轻摇动,清洗残留的培养液后弃之。
(3)加入适量的消化液,使其覆盖整个细胞,将培养瓶放置于CO2培养箱,不时在倒置显微镜下观察,当细胞胞质回 缩,胞间间隙增大后,吸出消化液,并向培养瓶中加入含10%胎牛血清的培养液终止消化。
(4)用吸管吸取培养瓶中的培养液,反复吹打瓶壁制备细胞悬液,吹打时不能用力过猛,尽量不出现气泡,以免损伤细胞。
(5)细胞进行计数后,按照 1X105~106细胞/mL 密度将细胞接种于培养瓶中。
3. 培养细胞的观察及鉴定
采用倒置显微镜观察平滑肌细胞的形态及生长情况。细胞爬片HE 染色观察细胞形态,电镜检查,免疫组化染色检测α-SMA。