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大鼠脑微血管内皮细胞原代培养可以:(1)应用于血脑屏障的研究;(2)脑血管疾病的病理生理及分子生物学研究;(3)新药筛选;(4)脑微血管内皮细胞生理生化及药理学研究。
酶消化法
SD大鼠
纤连蛋白 Ⅳ型胶原 明胶 肝素钠 碱性成纤维细胞生长因子 青霉素 链霉素 NaHCO3 牛血清白蛋白 鼠尾胶 葡聚糖 DNA酶I D-Hanks'液 II型胶原酶
低温离心机 离心管 移液枪
一、实验材料准备
1. 实验动物
每次实验采用10只2-3周龄SD大鼠,雌雄均可,体重40~60 g。2. 试剂
纤连蛋白(fibronectin)、Ⅳ型胶原、鼠尾胶、葡聚糖(dextran,分子量100~200 kDa)和DNA酶I(DNase I)购自Sigma公司;D-Hanks'液、10×PBS按配方自制;II型胶原酶购自Worthington公司;明胶、牛血清白蛋白(BSA)、HEPES购自Amresco公司;Percoll 购自Amersham Biosciences;DMEM(高糖)购自GIBCO/BRL公司;肝素钠、NaHCO3购自中国医药集团上海化学试剂公司;青、链霉素购自上海生工生物工程有限公司;胎牛血清(FBS)购自PAA Laboratories;碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),胶原酶/分散酶(collagenase/dispase)购自Roche公司。
3. 仪器
低温离心机(Centrifuge 5810 R,购自Eppendorf;Himac CR 22F,购自Hitachi)。
4. 试剂配制
(1)1 mg/ml鼠尾胶(用0.2%乙酸配制),1%明胶(用D-Hanks'液配制),1%II型胶原酶(用DMEM配制,用时稀释成0.1%的浓度),1%胶原酶/分散酶(用DMEM配制,用时稀释成0.1%),15%葡聚糖(用PBS配制),20% BSA(用DMEM配制,调pH值至7.4后用0.45 μm滤膜过滤除菌,较难过滤),DNase I(用冷PBS配制成2 U/μl),以上试剂经0.22 μm滤膜过滤除菌后分装保存于-20℃。(2)50%Percoll(配12 ml,需6 ml Percoll原液,0.67 ml 10×PBS,0.4 ml FBS,4.93 ml PBS);DMEM培养液(含4000 mg/L D-葡萄糖,4 mmol/L L-谷氨酰胺,添加3.7 g/L NaHCO3,20 mmol/L HEPES,肝素钠 100 mg/L,青霉素 100 U/ml,链霉素 100 μg/ml),pH值调至7.4,过滤除菌后分装保存于4 ℃,用时加入20% FBS及1 ng/ml bFGF。
二、培养皿预处理
1. 涂布3种不同的基质,培养前一天加入1 ml 1%明胶于35 mm塑料培养皿,置于37 ℃培养箱过夜,接种前用D-Hanks'液漂洗2次。2. 接种前4 h,加入鼠尾胶6~10 μg/cm2,在密闭的器皿里用氨气熏5~10 min后,置于室温1~2 h晾干后,用D-Hanks'液漂洗2次。3. 50 μl 0.1%纤连蛋白、50 μl 1 mg/ml Ⅳ 型胶原和400 μl双蒸水混合后,加入到每个培养皿中涂布均匀后吸出,可涂布10个培养皿,置于37 ℃培养箱1~2 h晾干后,用D-Hanks'液漂洗2次。