Inscopix系列的大脑超微钙成像系统一般用在啮齿类动物身上的居多，因为设备体积小，重量轻，且在实验时动物可以自由活动而成像质量不受影响，因此受到了很多神经科学研究者的青睐。
但在最近的一篇来自Inscopix公司和美国德克萨斯大学奥斯汀分校的研究人员在bioRxiv上发表的文章则描述了inscopix nVista头戴式显微钙成像设备应用在猕猴身上的研究，该研究将两个inscopix钙成像设备埋植在猕猴左右两侧的大脑上，对采集到的钙离子活动信号通过数学模型的分析解码，实现了将神经信号与行为动作的解读关联。实验方法并不复杂，并且还实现在清醒可自由动作的灵长类动物上。下面我们对这篇文章的实验及分析过程进行介绍。
格罗贝尔生物科技公司（美国Global Bietech Inc）是Inscopix进入中国后于2017年首次且始终授权的中国代理商，拥有几十家国际国内YI流科研水平的实验室用户服务经验。始终如一高水平售后技术服务是您完成此项实验的根本保障，请在购买前与我们做更深入的技术咨询和交流！
文章首先对在猕猴头上安装头戴式微型显微内窥镜的手术操作进行了讲解，手术环节分为两个部分，首先是将病毒注射到感兴趣的大脑区域以表达经过基因编辑的钙指示蛋白，第二个是将长期型内窥透镜植入到目标位置（图1）。
对于猕猴皮质中表达钙指示蛋白，他们采用了两种基于AAV的策略（图1B），一种是使用传统AAV表达实现基于GCaMP的钙成像，第二种是将两种病毒混合在一起构成AAV Tet-Off病毒系统。与常规策略相比，该系统可在较短时间内表达较高水平的GCaMP，它的GCaMP表达是TET依赖的，因此对动物施用强力霉素可暂时抑制GCaMP的表达，这对于在长期成像中防止发生过度表达很重要。经过试验，这两种方法均可在皮质中产生足够的GCaMP6f表达，并在皮质各个位置均有充分分布。观察表达GCaMP的细胞的形态，发现在CaMK2a病毒参与下，蛋白表达偏向于兴奋性锥体神经元；而在Tet-Off病毒系统下，则偏于泛神经元表达，这与以前的报道一致。与传统只表达CaMK2a病毒相比，Tet-Off病毒系统在注射后的相同时间点可以观察到更高的表达水平。
他们将成像区域定为大脑左右两侧的背外侧运动前皮层（PMd）前肢区域，依靠实验前扫描得到的猴脑MRI图像以及标准解剖图集对猴脑建立立体图像以确定实验坐标。在左半球的PMd，注入Tet-Off病毒系统的两种病毒；在右半球PMd，注入AAV1.CaMK2a.GCaMP6f。实验中对病毒注射位点拍照记录，在颅骨上做基准点标记，并在硬脑膜切开处使用人工硬脑膜以防止切口处软脑膜和蛛网膜上的心血管生成，这样在后续埋植透镜时能更准确地找到病毒注射位置。在脑中植入的是斜端面透镜，植入位置在皮质下面2mm处，在猴颅骨上拧入骨螺钉，将埋入的透镜，显微镜底座，以及一个定制的可以包住整个埋植透镜的带盖腔室，一起用水泥/丙烯酸树脂固定在头骨上（图1A）。由于颅骨切口完全用水泥/丙烯酸树脂密封，植入物感染风险低，几乎不需要维护。一旦完成上述两个手术步骤，就可以对动物进行钙成像观察记录了。
图1，猕猴背外侧运动前皮质的细胞分辨率成像。
细胞级别分辨率的钙成像
透镜植入手术后大约两周就可以观察细胞钙活动。这种头戴式微型显微镜和植入设计的主要优势在于，它操作简单，插上显微镜即可观察。放置显微镜时，猴子可舒适的坐在工学设计的标准灵长类动物椅子上，头部被暂时限制活动以完成微型显微镜对接，将软垫靠在猴头侧面，将腔盖拿开，取下微型镜底板上的保护盖，将微型镜对接至底板，拧紧固定螺钉，不到2分钟即可完成整个操作，然后放开动物头部开始成像。
在透镜植入两周后进行的第&一个成像过程中，研究人员观察到了表达GCaMP的细胞和相应的细胞钙活动，实验猴进行伸手任务，成像观察4周后，活动细胞数量开始上升并达到相对稳定的值（图1C-F）。成像过程中，动物头部完全不受约束，可自由移动和咀嚼食物。尽管实验动物的下颌，头部和身体有明显的运动，但成像视野还是非常稳定的，仅通过标准的刚性平动校正算法就可在整个记录过程中精确记录帧。实验期间，在所有记录的视频帧中，应用校正值的中位数为0.75μm，比成像细胞的平均大小要小一个数量级。运动校正后，头部运动与视野平移之间的微小误差可以完全缓解。
数据分析使用了CNMFe（constrained nonnegative matrix factorization，一种用于从单光子微内窥镜钙成像数据中识别细胞的常用算法）来识别单个细胞并提取其细胞钙活动。在展示的左半球记录示例中，算法确定了106个单细胞（图1C-D）。钙事件具有足以通过标准事件检测算法的信噪比，且钙离子活动符合预期的典型模式，有快速上升和指数衰减的特性（图1E）。在这个记录里（图1F），整个神经元群中测到的信噪比和事件发生率均与在啮齿动物模型的钙成像研究中通常观察到结果相似。右半球PMd的成像细胞明显减少，可能是由于透镜相对于表达GCaMP的细胞区域的放置位置不是最&佳。但从这些细胞中检测到的钙事件与从左半球细胞中观察到的信噪比和事件发生率是相似的。
在长期钙活动记录中追踪单个神经元群
研究人员在不到8个月中一共进行了66次成像记录，在开始4个月中连续进行了42次记录（图2A），之后暂停。动物全身注射荧光染料以进行镇静血流成像，经一个月后，恢复了钙活动成像，但血液荧光染料完全干扰了检测GCaMP荧光信号的能力。研究人员在第6个月继续进行钙成像，测试Dox给药对测得的钙活动的影响。从第0天到第76天的32个成像阶段中（图2A），结果令人满意，总体成像质量和钙活动保持稳定（图2B-C）。左半球PMd中识别出的细胞数在间隔的记录之间波动，但总体相对稳定，记录细胞中位数为104个 [四分位数IQR 91-113] （图2B）。信噪比和检出钙事件率在各试验记录中也是相对稳定的，在右半球PMd的成像细胞中也观察到了相似的稳定性（图2C）。
比较左右半球细胞群在整个实验过程中的钙事件衰减，发现左半球的衰减明显比右半球慢，这在两个半球的SNR参数相同的情况下，表明左半球高表达GCaMP的细胞数量比右半球多，这也与组织学结果一致，表明在注射后的相同时间点，Tet-Off病毒系统会产生比常规CaMK2a病毒策略更高水平的表达。鉴于GCaMP过度表达会引发癫痫和细胞毒性，因此对于长期成像实验而言，将表达水平保持在合理范围内非常重要。研究人员另外测试了Dox给药对测得的钙动力学的影响。如预期的那样，Dox的使用导致GCaMP表达水平显著降低。使用Dox 8天后停用3天，鉴定出的细胞数量从75减少到0，施加Dox还会加快钙事件的衰减。停用Dox大约40天后，整个视野的平均荧光，鉴定的细胞数量和荧光衰减都恢复到Dox之前的水平。在第&一次记录算起的第8个月进行的成像记录中，成像质量，钙动力学和事件发生率与前4个月记录的结果相当。这些结果表明，Tet-Off病毒策略表达GCaMP可在长达数月的长期成像中将指示蛋白表达维持在可接受水平内。
图2，钙成像稳定性和神经元的纵向跟踪。
因为实验中的成像质量和钙活动检测的整体稳定性比较好，研究人员尝试追踪单个神经元，这是钙成像相比电生理的主要优势。对两个在不同时间点记录的钙活动录像，他们首先用CNMFe提取两次记录中的细胞图，记录细胞位置，这样每个细胞就有相对于其他细胞的相对位置（图2D）。通过计算两组数据中的关联位置，检测推算其中的相同细胞。空间相关性分数高于阈值的细胞对被推定为相同细胞。对于图示的记录匹配，实验方法能够将第29天成像的细胞中的63％识别为第36天成像的相同细胞。在对所有成像进行计算后，在最小间隔1-4天的记录中，有中值约为70％的细胞可确认为同一细胞，在间隔67-73天的记录中，有约40％为同一细胞（图2E）。进一步尝试是否可以通过多个连续的成像记录而不是简单地通过任何两个记录来追踪相同神经元。实验研究了7个成像记录的集合，跨越大约3周时间，应用自定义纵向匹配算法（图2F），在多个成像记录中跟踪相同的神经元，发现有68个细胞只在一个记录里活跃，有17个细胞在所有7个记录里都活跃。这些结果证实了这种成像方法可以在数月的时间里对活动猕猴脑中大量神经元钙活动进行成像，且成像质量具有足够的稳定性，可以长时间纵向追踪单个神经元。
综合神经元钙活动，解码自然伸手动作
接下来，研究人员将神经元的钙离子活动与动物动作进行直接关联。首先训练动物的伸手动作，在动物面前有左右两个位置，随机交替放置食物奖励，动物伸手取食（图3A）。根据先前的电生理实验研究，预期是在动物伸出左手或右手时，其神经元活动对其伸手方向有选择性活跃，对侧手臂活动对神经活动有响应。实验结果证实了期望，在图表展示的左半球记录中，动物正用右臂伸手，几个神经元在向区域1和区域2伸手期间，钙离子活动均有增加且发生钙事件的可能性更高，其他细胞则表现出对伸手到区域1相比区域2有更多的钙活动，反之亦然。图表的三个示例清楚地展示了神经元独特的选择倾向（图3B），无论是钙事件还是在钙离子活动变化上。
在示例记录里可观察到，整个成像细胞群体的钙活动变化与伸手动作调节的多样性，大多数细胞表现出与一个或两个伸手方向相关的活跃变化（图3C）。研究人员计算了一个调整指数，来捕捉每个细胞在整个细胞群中对伸手方向的选择性程度（图3D）。实验完成后，他们用该指数将细胞分为1区选择性，2区选择性和非选择性细胞，发现在78个细胞中有35个为选择性细胞，1区占20％，2区占17％。他们将这种方法应用每个记录中，发现在不同记录中存在相同比例细胞对区域1和区域2有选择性（图3E）。将所有记录里的细胞用该指数分类，然后将经过分类细胞的分布重新映射到大脑的成像视野里，评估PMd是否在空间上组织了伸手方向的选择性（图3F）。在这些选择性映射图中，没有发现任何明显的空间组织。为了测试具有类似选择性的细胞是否倾向于分布位置更靠近一些，研究人员计算了一个聚类指标，即最邻近细胞具有相似选择性的频率。度量值显著大于0.5表明类似选择性细胞有明显群集。对于图3F中所示的记录，聚类指标为0.57，但与0.5没有显著差异。本研究中使用的GRIN斜端面透镜允许同时成像散布在多个皮质层上的细胞。在评估了方向选择性细胞所占比例与特定皮质层的关系后结果发现，在视野内皮质的全部深度上，具选择性细胞的比例相当均匀。
图3，方向选择性钙动力学和伸手行为的解码。
考虑到所记录的细胞群中对伸手位置选择性的钙活动，研究人员猜想是否可以用细胞群体钙活动经多次试验来逐步解码动物伸手方向。使用偏最小二乘判别分析和留一法交叉验证，从400 ms（帧长度100 ms）记录里所有被识别细胞的连续钙活动变化中解码伸手方向（图3G）。解码结果的准确率远大于随机水平，并在手进入相应选择区域时达到峰值。不同记录之间的解码准确性保持稳定。尽管相对于连续钙活动记录，钙事件数据量较少，但基于钙事件解码的准确性也大大超过随机概率（图3G）。如同预期，解码精度取决于训练解码&器所用的信元数量，即便只有一个训练信元，准确性依然高于随机水平。
跟踪随时间变化的细胞群体钙离子活动与动物行为之间的关系
已经确定猴脑左右半球PMd神经元钙离子活动均表现出对伸手方向具有选择性（图3），并验证了钙成像方法跨时间纵向跟踪神经元群的能力（图2），研究人员接下来研究单个神经元的方向选择性随时间推移的变化或保持稳定的程度。他们将分析重点放在了左半球的部分记录上，在这部分记录里动物完成了足够数量的伸手试验，跨2个星期，进行了5次记录（图4A）。图示记录中，已在空间上标定了它们的细胞映射，并推定了82个同一细胞（图4A），然后比较两个记录里同一细胞的调整指数，观察到显著的相关性，且总体调整指数没有变化（图4B）。时间间隔增加后，两个记录之间调整指数的相关性仍然很高，调整指数变化仍然很低，这表明PMd细胞经过2周时间仍具有稳定的方向选择性（图4C）。
图4，纵向探索神经元和伸手行为的关系。
根据跨时间追踪细胞测得的总体调整指数相对稳定，研究人员预测，用特定记录的钙活动变化训练解&码器，然后对记录自其他时间点的钙离子活动进行解码也会表现得相当好。示例的两个记录，在对原记录和跨一天记录的测试中，解码精度均远高于随机水平（图4D）。把记录间隔时间加长，大多数情况下，峰值解码精度仍高于随机水平（图4E），这表明PMd对伸手方向的编码在几天到几周内相对稳定。对这些神经元的纵向跟踪增进了我们对神经活动与行为之间动力学关系的理解。
背外侧运动前皮质多个部位的双侧钙离子成像
迄今得到的结果分别来自左半球或右半球PMd，而动物伸展手臂在记录半球对侧。在第20天到第76天的记录中，研究人员还同时从两个半球成像（图5）。由于微型镜的体积小，头部上有足够的空间来安装两个微型镜，如果研究有需要甚至可以容纳更多的镜头。为了利用双边成像功能，首先对动物进行训练，使其执行类似前述实验的动作，只不过训练动物用右臂伸到区域1，用左臂伸到区域2（图5A）。这样与左右半球PMd的同时记录相结合，使他们能够在逐次试验的基础上研究手臂伸张如何在大脑两侧进行编码的。
实验证明左右半球均有同侧或对侧伸手选择性的细胞钙活动（图5B-C）。在图5所示的双边记录中，有些细胞在同侧伸手和对侧伸手时均有增加的钙活动，有些细胞在对侧伸手时钙离子更加活跃，有些则在同侧伸手时钙离子更加活跃。每个半球的三个示例清楚展示了这些选择性（图5B）。研究人员在双边成像的细胞群中观察到了大量与伸手相关的钙离子活动调节差异（图5C）。大多数细胞显示出与对侧伸手有关的显著活动调节，但仍有少数细胞对同侧伸手敏感。
图5，使用多个头戴式显微镜在大脑双侧皮质多位点进行钙成像。
鉴于在两个半球记录中的神经元对同侧和对侧伸手均存在选择性，研究人员尝试是否可以使用双侧整体的细胞钙活动来解码发出动作的手臂身份。如前所述，他们采用留一法交叉验证的PLS-DA模型，以100毫秒帧的400毫秒幻灯片连续钙活动来解码左臂或右臂动作。在此示例记录中，解码精度远高于随机，并在进入区域时达到峰值（图5D）。峰值解码精度在整个记录中稳定（图5E）。这些结果证实了同步多点成像的可行，并给出了初步数据，应用这些功能加深了我们对双边编码伸手动作的理解。
参考文献：
Anil Bollimunta, Samantha R. Santacruz, Ryan W. Eaton, Pei S. Xu, John H. Morrison, Karen A. Moxon, Jose M. Carmena, Jonathan J. Nassi. Head-mounted microendoscopic calcium imaging in dorsal premotor cortex of behaving rhesus macaque.
Inscopix的nVista™和nVoke™解决方案在世界重要刊物上已发表100多篇文章，使科学家们对大脑有了更深刻的认识，进而描绘出动物自由活动时大脑清晰活跃的神经网络。
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