1.4.2 肺组织标本留取 打开未经支气管肺泡灌洗的各组各 6 只小鼠胸腔 ,观察肺脏的大体改变 ,剪取部分肺组织 ,经10 %甲醛固定后切片 ,行 HE染色。
1.5 CD4+T细胞的分离及鉴定
1.5.1 CD4+T细胞的分离 打开小鼠腹腔 ,无菌取出脾脏放入冷 Hanks液中 ,将其捻碎并滤过 100 目无菌钢网 ,收集脾细胞悬液加入到淋巴细胞分离液中 ,2 000 g 离心 30 min ,沿管壁轻轻吸出中间灰白色细胞层 ,重悬于含 10 % FCS的 RPMI 1640溶液中 ;按每 1 ×108个细胞加入尼龙毛柱中 ,37 ℃,5 %CO2孵箱中孵育 1 h;打开下端出口 ,使 T细胞悬液以 40～60 滴(Drop ,d)/ min 流出 ,用 RPMI 1640 溶液反复洗柱至洗脱液达 6～8 ml ,将细胞悬液按每 1 ×107个加入 CD8+mAb 包被的聚苯乙烯平皿中 ,并加入 RPMI 1640 溶液 2 ml ,混匀 ,4 ℃作用 70 min ,每 20 分钟轻轻旋摇 1 次 ,沿平皿壁吸取细胞悬液并用 RPMI 1640 溶液轻洗 2 次 ,2 000 g离心 10 min ,收集的细胞悬液即 CD4+T细胞。经台盼蓝计数 ,细胞存活率 > 89 %。
1.5.2 CD4+T细胞纯度鉴定 采用流式细胞术(Flow cytom2etry ,FCM)鉴定 CD4+T细胞纯度[1]。
1.6 统计学分析 各组结果以 ?x ±s 表示 ,各组间比较采用非配对 t 检验。
2 结果
2.1 小鼠致敏模型的肺组织病理改变 致敏组小鼠的肺脏与正常对照组小鼠的肺脏相比体积明显增大 ,表面肿胀 ,有多处形状不规则的暗红色充血区。切面有白色泡沫状渗出物 ,并可见明显的血管断面。肺组织切片HE 染色可见支气管及血管周围有大量的炎性细胞浸润 ,以EOS为主 ,肺间质及肺泡腔内也可见 EOS浸润。细小的支气管内可见粘液栓。气道上皮多处断裂 ,基底膜明显增厚且形态不规则。细支气管平滑肌发生肥厚性增生。
2.2 外周血及 BALF中 EOS %
2.2.1 外周血 EOS% 致敏组小鼠外周血 EOS%(11. 0 ±2.7)与正常对照组(0.7 ±0.5)比较显著增高( P < 0.01) 。
2.2.2 BALF中 EOS% 正常对照组小鼠 BALF 中几乎没有EOS(0.0 ±0.01) ,致敏组小鼠 BALF 中 EOS%(21. 9 ±4. 4) 与正常对照组比较显著升高( P < 0.01) 。
2.3 CD4+T细胞纯度鉴定结果
经 FCM检测 ,CD4+T细胞的纯度为 97.3 % ,见图 1。
图 1 FCM检测 CD4+T细胞纯度
3 讨论
本实验建立的 BALB/ c 小鼠致敏模型病理表现为:肺脏明显水肿 ,细、小支气管内有多量的粘液栓 ,气道上皮断裂、脱落 ,基底膜增厚 ,支气管及肺血管周围有以 EOS为主的大量炎性细胞浸润 ,与哮喘的病理学特点相似 ;同时 ,此模型小鼠外周血及 BALF中 EOS %显著增加 ,与哮喘患者外周血及 BALF 中 EOS %的改变一致 ,说明此模型可用于哮喘的实验研究。
Panning 法又称洗淘法。它是运用抗原与抗体相结合的原理进行细胞分离的一种方法 ,具有简便 ,经济、细胞完整性好等特点。国外在 90 年代早、中期即将这种方法广泛用于实验中。随着科学技术的不断进步 ,目前国外用于分离细胞的方法主要是磁珠分离法[2]和流式细胞仪法[3],但其造价昂贵 ,在国内并不能
普遍开展 ,故运用 Panning 法分离细胞仍不失为一种高效、经济的方法。本实验用 Panning 法分离的 CD4+T细胞经 FCM检测 ,纯度高 ,完全可用于进一步的实验研究。
关键词 : 哮喘 ;模型 ;小鼠 ;CD4+T细胞
中图法分类号 : R - 332;R562.25 文献标识码 : B
参考文献 :
[1] 沈关心 ,周汝麟. 现代免疫学实验技术[M]. 武汉:湖北科学技术出版社 , 1998.180 - 183.
[2] Holmes B J , MacAry P A , Noble A , et al. Antigen2specific CD8+T cellsinhibit IgE responses and interleukin24 production by CD4+Tcells[J ]. EurJ Immunol ,1997 ,27(10) :2 657 - 2 665.
[3] Denkers E Y, Scharton2Kersten T, Barbieri S, et al. A role for CD4+NK1.1 + T lymphocytes as major histocompatibility complex class Ⅱinde2pendent helper cells in the generation of CD8+effectorsfunction against in2tercellular infection[J ]. J Exp Med ,1996 , 184(1) : 131 - 139.
(编辑 陈聪连)
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