质粒DNA提取实验步骤

质粒DNA提取可以：(1)快速纯化质粒;(2)用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学实验。实验方法原理质粒多为一些双链、环状的DNA分子，是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒是进行分子生物学实验操作，进行遗传工程改良物种等工作时最主要的DNA载体。

　　提取质粒的基本步骤分为三步：

　　①细菌的培养和质粒的扩增

　　②细菌菌体的裂解

　　③质粒DNA的纯化

　　实验材料 大肠杆菌

　　试剂、试剂盒 Tris-Hcl EDTA 葡萄糖 NaOH KAac NaAc 异丙醇 溶菌酶 酚:氯仿 无水乙醇 LB培养基

　　仪器、耗材 超净工作台 培养箱 摇床 恒温水浴锅 台式离心机 取液器 低温冰箱 冷冻真空干燥机电泳仪 水平电泳槽 紫外观测仪

　　实验步骤 一、材料与试剂准备

　　1. 材料：大肠杆菌。

　　2. 仪器：超净工作台，培养箱，摇床，恒温水浴锅，台式离心机，取液器一套，低温冰箱，冷冻真空干燥机，电泳仪，水平电泳槽，紫外观测仪。

　　3. 试剂：

　　(1)Solution I ：25 mM Tris-Hcl(pH7.4)，10 mM EDTA(pH8.0)，50 mM葡萄糖，高压灭菌，4℃保存。

　　(2)Solution II ：0.2 M NaOH， 1%SDS 现配现用。

　　(3)Solution III ：5 N KAc pH4.8，高压灭菌，4℃保存。

　　(4)3 M NaAc pH5.2，高压灭菌，4℃保存。

　　(5)异丙醇，溶菌酶(8 mg/ml)，酚/氯仿，无水乙醇，70%乙醇，LB培养基，电泳试剂。

　　二、操作步骤

　　1. 细菌繁殖：LB培养基，2 ml/20 ml，37℃，200 rpm，摇一摇，过夜。

　　2. 离心10 min，5 000 rpm， 4℃;弃上淸液。

　　3. 沉淀(菌体细胞)预冷的TES缓冲液洗涤，离心10 min，5 000 rpm， 4℃，加入预冷的1 ml Solution I，冰浴10 min。

　　4. 重新悬浮，加入150 ul溶菌酶母液，室温放置5 min。

　　5. 加入1.2 ml Solution II， 冰浴5 min。

　　6. 加入0.9 ml预冷乙酸钾，混匀，离心10 min，12 000 rpm，4℃。

　　7. 加入1.5 ml异丙醇，-20℃冰箱内放置15 min。

　　8. 离心10 min，12 000 rpm，4℃。

　　9. 取沉淀，悬于400 ul TE缓冲液中。

　　10. 加入40 ul，3 M NaAc。

　　11. 酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀。

　　12. 离心10 min，12 000 rpm，4℃。

　　13. 取沉淀，冷冻干燥，再悬浮于50 ul TE缓冲液中。

　　14. 电泳检测提取DNA的质量。