感受态制备：酵母感受态细胞制备实验

YPDA液体培养基 蒸馏水 甘油 二甲基亚砜

培养皿 离心机 离心管 冰箱

一、试剂与耗材

1.  试剂
 
细菌用-酵母提取物（Fisher）、 细菌用-蛋白胨（Fisher）、葡萄糖（Fisher）、细菌用-琼脂粉、去离子水、甘油(Sigma)、二甲基亚砜(Sigma)、聚乙二醇3350(Sigma)、醋酸锂(Sigma)、鲑鱼精子细胞DNA(Invitrogen)、酵母无氨基酸氮源(Sigma)、 2-(N-吗啉代) 乙磺酸、腺嘌呤(Sigma)、葡萄糖。
 

2.  仪器
 

水浴锅(VWR)、离心机(Eppendorf)、30 °C摇床与恒温培养箱(VWR)、培养皿。

二、 试剂配方
 

1.  YPDA液体或固体培养基
 

（1）1%酵母提取物： 10 g/L
 

（2）2%胰蛋白胨： 20 g/L
 

（3）2%葡萄糖：20 g/L
 

2.  转化液
 

（1）聚乙二醇3350(50 % (w/v)：260 μl
 

（2）1 M醋酸锂：36 μl
 

（3）SsDNA（10 mg/ml）：10 μl
 

（4）质粒：3 μl
 

（5）总计：360 μl
 

3.  YNB+ MA 培养基（100 ml）
 

（1）YNB：0.67 g
 

（2）2-(N-吗啉代) 乙磺酸（20mM ）：0.39 g
 

（3）腺嘌呤：0.01 g
 

（4）琼脂粉：2g
 

（5）葡萄糖：2g

三、制备步骤
 

1.  在转化实验的两天前，于YPDA培养基的平皿上活化酵母菌株。
 

2.   转化前一天，挑取活化的酵母细胞（单克隆）于YPDA液体培养基中，30°C，200 rpm培养过夜。
 

3.  将培养过夜的酵母细胞液按1：3的比例转接与新的YPDA液体培养基中，于30°C摇床内，200 rpm培养4 h。
 

4.  3 000 g 离心 5分钟收集酵母细胞，用0.5倍体积的无菌水洗酵母细胞。
 

5.  再次3 000 g 离心 5分钟。
 

6.  用0.01倍体积的无菌水重悬酵母细胞，并转入适宜的离心管中，20°C ，3 000 g 离心 5分钟。
 

7.  用0.01倍体积的无菌细胞悬浮液(5 % v/v 甘油，10% v/v 二甲基亚砜)重悬酵母细胞。
 

8.  将重悬的酵母细胞按50 ul分装到1.5 ml离心管中。
 

9.  将管放入塑料盒或者纸盒中（逐步梯度冷冻能够增强酵母的存活率）。
 

10.  将装有酵母细胞的盒子放入-80°C冰箱。（细胞在-80°C能够保存一年以上）。
 

一、参考文献
 

1.  Gietz R.D., Schiestl R.H. (2007). Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat Protoc 2(1): 1-4.
 

2.   Lu Y., Chanroj S., Zulkifli L., Johnson M.A., Uozumi N., Cheung A., Sze H. (2011). Pollen tubes lacking a pair of K+ transporters fail to target ovules in Arabidopsis. Plant Cell 23(1): 81-93.