杂化颗粒C18色谱柱和乙酸流动相进行肽的高载量研究 二
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结果与讨论
含有九种组分的肽混合物的载量研究
在之前的研究中，已经对CSH130 C18和BEH130 C18在分析型肽分离中的应用(例如肽图绘制)进行了广泛的探讨8-9。简而言之，与其他肽分离反相填料相比，CSH130 C18及其创新的表面带电技术能够改善峰形和载量。在分析型应用中，尤其是在流动相含有极少或不含离子对试剂时，可以观察到峰容量有显著升高，最高达到90%。与BEH130 C18相比，CSH130 C18的表面正电荷还提供了独特的选择性和较低的保留性，使得它们成为肽分离色谱填料的绝佳搭配。
为了研究CSH130 C18和BEH130 C18在制备型分离中的表现，采用生产中常用的流动相(即含有TFA或HOAc的流动相)对一系列不同肽进行了载量研究。这些方法开发实验中使用的是5μm颗粒填充的分析柱(4.6mm内径)。
首先在这些色谱柱上进行测试的是MassPREP肽混合物，其包含九种不同的肽，如表1所示。图1所示为该混合物在半制备型上样下的一组色谱图，其中使用了BEH130 C18和CSH130 C18，以及两种不同的流动相，一种含有0.1%TFA，另一种含有0.1%HOAc。使用0.1%TFA时，BEH色谱柱的平均4峰宽为0.8min。使用0.1%HOAc时，平均峰宽几乎翻了一倍，达到1.5min。HOAc的酸性比TFA弱得多，从而导致流动相酸性减弱，离子强度和离子配对能力均显著降低。因此预计使用HOAc代替TFA时，大部分C18柱的峰形会较差。这一假设对于BEH130 C18的半制备型上样是成立的，如图1所示。然而对于CSH130 C18色谱柱，用HOAc替换TFA时峰形仍保持良好。使用0.1%TFA流动相和0.1%HOAc流动相时，在CSH130色谱柱中观察到的平均4峰宽分别为0.5和0.6min。峰宽数据汇总于图2中，其中分别绘出了在不同色谱柱类型和流动相条件下混合物中每种肽的峰宽。除了半制备型上样量的数据之外，图中还显示了分析型上样量的数据。此图表明BEH130
C18和CSH130 C18在一些条件下会生成类似的肽峰形，包括0.1%TFA的分析型上样量。但是，在其他条件下，例如0.1%HOAc的半制备型上样量，CSH130 C18生成的峰要窄得多。正如之前研究所证实8-9，CSH130 C18在使用含有极少或不含离子对试剂的酸性流动相时，获得的肽峰形明显更好。同时也表明，当上样量高于常规分析20倍时，这种现象更为明显。
低纯度合成肽
制备型分离往往要求上样量必须达到(有时要高于)分析型分离所用上样量的1000倍。使用序列为DFVGYGVKDFVGVGVK的低纯度合成肽(一种中性肽，pI=6，1.7kDa)，对低于此范围和此范围之内的上样量进行研究。在BEH和CSH色谱柱上采用聚焦梯度分离以缩短运行时间，使用低灵敏度波长(250nm)检测以获取完整峰形。
首先使用经0.1%HOAc调节的流动相对半制备型和制备型上样量进行分析，如图3所示。BEH色谱柱上的半制备型上样量(50μg)产生的目标肽峰带有明显拖尾，这与常见的Langmuirian等温线一致。相反，在制备型上样量(1mg)下，目标肽的洗脱峰呈略微前伸，正如典型的anti-Langmuirian等温线。我们知道，当肽以两性离子形式存在时，就会出现anti-Langmuirian等温线10。由此可知，经0.1%HOAc调节的流动相酸性不足以将这种合成肽的羧基完全质子化，肽可能同时以阳离子和两性离子存在。两性离子的相对含量应随上样量增大而增大，尤其是在目标肽浓度超过流动相的质子化/缓冲能力情况下。这就解释了BEH色谱柱上样量增大时峰形出现的巨大变化。
有趣的是，正如在图3中所看到的，对于BEH130 C18，在制备型上样量下使用0.1%HOAc似乎更容易获得较窄的目标肽峰。在这些条件下，BEH色谱柱得到的目标肽峰比CSH色谱柱更窄。事实上，CSH130 C18使用0.1%HOAc时在两种上样量下都获得了前伸峰。由于其表面所带的正电荷最大程度地减少了肽的拖尾，所以出现这种情况是意料之中的8-9。因此，前伸峰形也更加明显。由于没有拖尾峰，制备型上样量下CSH柱的目标峰宽度实际上要大于BEH柱。
