morris水迷宫&八臂迷宫实验方法

一、Morris 水迷宫

本实验由美国科学家 Richard GM Morris 于 1981 年建立。最初用于研究脑内结构对学习和记忆的调节作用，后来逐步发展成为目前最为常用的评价动物学习与记忆的模型。这一实验的基础是，啮齿类动物在水中有强烈的逃避水环境的动机，并以最快、最直接的途径逃离水环境。学会逃避水环境的过程体现动物的学习能力；根据周围环境进行空间定位，有目的地游往水中安全的地方（平台），体现动物的空间记忆能力。

（一） 实验设备

实验用大鼠或小鼠进行。大鼠水迷宫实验设备由上海欣软信息科技有限公司（www.softmaze.com）制造，包括一个灰色或黑色圆形水池（直径 160cm，高 55cm；小鼠规格尺寸减半）、一个平台（直径 10cm）、一台跟踪摄像机以及摄像机相联的计算机（图 25-1）。池内盛水，深 50cm，水温为摄氏 22~24℃。平台置于水面下 2cm（小鼠为 1cm）。在水中加入奶粉或牛奶将水搅浑以免让动物看清水下平台。摄像机位于水池中央上方 200cm，可记录动物的位置、游泳距离和时间（从而可计算出游泳速度）以及游泳路径等。房间周围墙壁上贴上色彩鲜明、形状不同的图画用为迷宫外暗示（extra-maze cues）。

（二） 实验方法 分获得性训练、探查和对位训练 3 个过程。

1．获得性训练（Acquisition phase）理论上将水池分为 4 个象限，平台置于其中一个象限区的中央。

（1） 将动物（大鼠或小鼠）头朝池壁放入水中，放入位置随机取东、西、南、北四个起始位置之一。记录动物找到水下平台的时间（s）。在前几次训练中，如果这个时间超过 60s，则引导动物到平台。让动物在平台上停留 10s.

（2） 将动物移开、擦干。必要时将动物（尤其是大鼠）放在 150W 的白炽灯下烤 5min，放回笼内。每只动物每天训练 4 次，两次训练之间间隔 15~20min,连续训练 5d。

2．探查训练(probe trial 1)最后一次获得性训练结束后的第二天，将平台撤除，开始60s 的探查训练。将动物由原先平台象限的对侧放入水中。记录动物在目标象限（原先放置平台的象限）所花的时间和进入该象限的次数，以此作为空间记忆的检测指标。

3．对位训练（reveral phase）测定动物的工作记忆（working memory）。探查训练结束后的第二天，开始维持 4 天的对位训练。将平台放在原先平台所在象限的对侧象限，方法与获得性训练相同。每天训练 4 次。每次记录找到平台的时间和游泳距离以及游泳速度。4．对位探查训练（probe trial 2）最后一次对位训练的第二天进行。方法与上述探查训练类似。记录动物 60s 内动物在目标象限（平台第二次所在区）所花时间和进入该区的次数。

（三） 注意事项

1．对比食物驱动的模型（如放射臂迷宫），水迷宫实验的最大优点在于，动物具有更大的、逃离水环境的动机。而且不必禁食，特别适合老年动物的测试。加上它对衰老引起的记忆减弱尤其敏感，因此，水迷宫最常用于老年动物记忆的研究。

2．如用小鼠，除游泳池尺寸约为大鼠的 50%以外，平台直径也较少（7.5cm）。实验方法与大鼠类似，但训练周期较短。一般获得性训练 3 天共训 16 次（第一天 4 次，后两天每天 6次；两次训练之间的间隔 5~10min，第四天为探查训练，第五、六天为对位训练，每天训练六次，第七天为第二次探查训练。

3.如用肉眼观察，在所有试验过程中试验着始终坐在同一位置，距离泳池最近的边缘约60cm。

4．每天在固定时间测试。操作轻柔，避免不必要的应激刺激。

5．当与其他同类实验相比较时，要注意到动物的性别、品系、泳池的尺寸和水温等多种因素对实验结果的影响。此外，当以游泳速度作为观察指标时，要考虑到动物的体重、年龄以及骨骼肌发育状况等对游泳速度可能造成影响。

6．用老年动物进行实验时，应确认动物的游泳能力和视力不因年龄增大而影响行为操作。其方法如下：将平台露出水面以使动物能够看见平台。动物放入泳池后如毫无困难地直接游向平台，说明动物的游泳能力和视力均正常，可以开始实验。

7．游泳对动物是一个较大的应激刺激，可引起神经内分泌的变化。这些变化可能对实验结果造成干扰。对老年动物，严重时可诱发心血管疾病而导致卒中甚至死亡。因此，必要时可将动物多次放入泳池或适当延长其游泳时间以增加动物对游泳的适应能力。

8．当用牛奶或奶粉搅浑泳池的水时，要定期换水以免水腐败变质；如用白漆达到同样目的时，必须确保白漆对动物没有毒性。

二、放射臂迷宫(八臂迷宫)

八臂迷宫（放射臂迷宫（radial arm maze））实验也是最为常用的评价动物学习记忆能力的模型之一，由 Olton 等人于 20 世纪 70 年代中期建立。其基本依据是，控制进食的动物受食物的驱使对迷宫各臂进行探究；经过一定时间的训练，动物可记住食物在迷宫中的空间位置。该方法可同时测定动物的工作记忆（working memory）和参考记忆（reference memory）。所用动物包括大鼠、小鼠和鸽子。这一模型对脑区毁损和多种药物均很敏感。后者包括乙醇、东###（抗胆碱能药）和 MK-801(NMDA 受体拮抗剂)等。

（一） 实验设备

实验多数采用八臂放射迷宫，也有采用 十二臂或者二十四臂迷宫。这里介绍上海欣软信息科技有限公司生产的八臂迷宫。每个臂长 41.9cm，宽11.4cm，高 10.1cm；其上有一透明盖，两侧各有两个相对的光电管。迷宫中央八角形区的直径为 27.4cm；上有一透明顶盖。中央区通往各臂的入口处有一活动门，用来对动物的出入臂进行控制。迷宫与计算机相联。也可用摄像跟踪系统（video tracking system）取代光电管来记录动物在迷宫内的活动行为。放置迷宫的房间内有一些外部暗示（extramaze cues）。动物在迷宫内可以看见这些暗示，并借此进行空间定位。实验用大鼠或小鼠进行。

（二）实验方法

1．动物适应实验环境 1 周后，称重，禁食 24 小时。此后每天训练结束后限制性地给予正常食料（据体重同，大鼠 16-20g，小鼠 2-3g），以使体重保持在正常进食大鼠的 80%~85%。

2．第二天，迷宫各臂及中央区分撒着食物颗粒（每只 4~5 粒，直径约 3~4mm）。然后，同时将 4 只动物置于迷宫中央（通往各臂的门打开）。让其自由摄食、探究 10min。

3．第三天，重复第二天的训练。这一过程让动物在没有很强的应激条件下熟悉迷宫环境。

4．第四天起，动物单个进行训练：在每个臂靠近外端食盒处各放一颗食粒，让动物自由摄食。食粒吃完或 10min 后将动物取出。

5．第五天，将食物放在食盒内，重复前一天的训练，一天 2 次。

6．第六天以后，随机选 4 个臂，每个臂放一颗食粒；各臂门关闭，将动物放在迷宫中央；30s 后，臂门打开，让动物在迷宫中自由活动并摄取食粒，直到动物吃完所有 4 个臂的食粒。如经 10min 食粒仍未吃完，则实验终止。每天训练两次，其间间隔 1h 以上。

记录以下 4 个指标：1工作记忆错误（working memory errors）,即在同一次训练中动物再次进入已经吃过食粒的臂；2参考记忆错误（reference memory errors ），即动物进入不曾放过食粒的臂； 总的入臂次数； 测试时间，即动物吃完所有食粒所花的时间。此外，计算机还可记录动物在放射臂内及中央区的活动情况，包括运动距离和运动时间等。连续 5次训练的工作记忆错误为零、参考记忆错误不超过 1 次时，可以开始药物测试或脑内核团结构毁损实验。一般先给溶剂（如生理盐水），再给削弱记忆的药物（如东MK-801 等），然后加用增强记忆的药物，剂量由低到高。

(三） 计算与数据分析

用两个指标评价动物的记忆，即工作记忆错误频率（frequency of working memory errors） 和参考记忆错误频率（frequency of reference memory errors） ,分别等于工作记忆错误或参考记忆错误与总的入臂次数的比率。用这两个指标分别评价工作记忆与参考记忆。同时，计算平均探究时间（average exploration time）,即测试时间与总的入臂次数之比，为评价一般运动活性的指标。根据毁损的脑区结构或所给削弱记忆的药物的不同，工作记忆错误频率和/或参考记忆错误频率显著增高，记忆增强药物或治疗可使这种错误频率降低。

（四） 注意事项

1． 小鼠放射迷宫设备和实验程序与大鼠类似，但迷宫规格应比大鼠迷宫小 1/4~1/2，以免增加小鼠行为操作难度。

2． 本实验也可只用来测定工作记忆。方法中唯一不同的是，在所有放射臂均放置食粒，而不是只选 4 个臂放置食粒。

3． 慢性应激对动物的迷宫操作可产生影响，且存在性别差异。经过慢性应激以后，雄性大鼠记忆力减弱，表现为记忆错误频率增加；雄性大鼠的空间记忆反而增强，表现为错误频率减少。

4． 即使在限制进食条件下，也应让大鼠体重每周增加 5g，以免动物因营养不良而患病。剔除身体状态不良的动物。

5． 迷宫周围的任何一件物品均可被动物用来作为空间定为的标志。去除或移动这些标志可能使动物操作困难并降低迷宫臂选择的准确性。

6． 根据实验目的的不同迷宫放射臂的数目可不同，包括 8、16、24、32、40 和 48 臂迷宫。迷宫臂越少要求动物记住探究过的臂也越小，动物的行为操作就越简单。增加臂的数目一方面增加了对动物空间记忆的要求，另一方面也引入了更多的、有必要考虑的干扰因素（例如过去的迷宫学习对目前所测记忆的影响）。所以，通常使用 8 臂放射迷宫，既可减少不必要的、过多臂的干扰，又可缩短训练和测试所花的时间。

7． 所用食物通常为小块的、带巧克力味（动物最喜欢的味道之一）或甜味的早餐圈（每块 10mg）；也可用液体食物（如巧克力奶或水）。后者对于测试某些影响动物对固体食物吞咽的药物（如东###）尤为实用。

8． 影响动物迷宫操作主要有两大因素：对迷宫或观察者的恐惧与动物探究习性和已知放在迷宫臂内食物的驱使。恐惧因素过强会阻止动物的迷宫操作，使动物始终停留在迷宫的某一个地方而不去探究。缺乏对食物的渴求也会产生类似结果，增加对动物的抚摸，必要时加高迷宫臂的侧墙，有助于减少动物的恐惧。如食物的驱使作用不足，可减少食物量，但必须同时监测体重和一般身体状况。通常大鼠体重不应低于禁食前的80%；对多数大鼠，体重降低 15%即可。

9． 与水迷宫不同，放射臂迷宫适合反复测试或长期记忆的测试。一般认为，工作记忆代表短期记忆，参考记忆代表长期记忆。