用BRET方法研究活细胞中GPCR蛋白相互作用的基本注意事项3

图2A：测量Rluc表达的发光模块的设置。双击“Read options”对话框下“Measurement”标签左侧的“lumin label”图2A：测量Rluc表

图2B：EYFP表达的荧光模块的设置，双击“Read options”对话框下“Measurement”标签左侧的“fluor label”    7. 在BRET试验方案中已经使用了COS-1细胞。然而，可以在任何细胞类型中进行的BRET也可以进行转染。各种转染试剂和技术可以应用于转染带有cDNA结构的细胞。在我们的手中，使用Polyfect  转染试剂（QIAGEN）可以获得一直的结果。然而，使用的转染试剂要随着选择的细胞类型而变化。 8. 在进行BRET试验时，Rluc比EYFP融合蛋白表达的水平重要。不同数量的Rluc 和  EYFP融合cDNA被传染和实验来决定获得最优化BRET信号的条件。融合蛋白的极限表达是不建议的。因为这可能增加非特异性BRET信号，增强阴性对照如：其他的Rluc和EYFP标记蛋白和感兴趣蛋白在同一水平表达的风险。然而，某些相互作用（低亲和性相互作用）可能需要较高蛋白表达水平来检测。除了蛋白质表达的cDNA转染总数，供体对受体蛋白表达的比率也是很重要的，研究每种蛋白质相互作用的最优化比率需要通过经验来确定。通过滴定的EYFP融合蛋白表达量，同时又保持了Rluc融合表达常数,   BRET50（使用荧光计测量EYFP融合蛋白表达，BRET值达到最大值的一半）可以确定为一个相互作用亲和力的相关性的近似措施。GPCRs在异源系统中的过量表达由于这些7TM高度的疏水性可能导致产生不真实的聚集和非特异性的BRET信号（10）。在受体表达的低水平或者在受体的生理水平以下进行BRET,可能有助于防止非特异性BRET信号。但是，蛋白质相互作用可能在相对亲和力方面各有不同，因此为了检测相互作用的BRET信号指示要求不同水平的蛋白质表达和不同比率的供体的受体分子。 9. 能够检测BRET信号仪器的主要特点是具有连续的滤光片，然后在两个不同波长范围进行测量发射光。目前有几种多功能酶标仪可以做这个实验，但是由于光学系统的原因，他们的灵敏度收到很大限制。相反，Mithras是一款多通路光学系统的多功能酶标仪，可以提供测量BRET信号要求的灵敏度（图2，独立光路系统）我们和berthold公司在研发能够测量高灵敏BRET信号的96孔板多功能酶标仪上进行合作。由于遇到上述蛋白质极端表达的问题，因此使用低水平的蛋白质表达如：接近或者低于生理水平，进行BRET实验和检测BRET信号是很重要的。因此，非常期望仪器能有检测低BRET信号，来降低由于BRET融合蛋白高表达带来的非特异性BRET信号。 10. 在添加腔肠素到细胞悬浮液时，由于荧光素酶反应显示快速衰减的动力学。所以需要立即测量发射光。最理想的方法是通过仪器带的试剂注射器来注射腔肠素，

图3A：选择底物和处理的进样器的孔，第四个进样器允许添加多个期望的处理到不同的孔中  

图4A：在选择注射孔以后，点击测量标签，双击左边的“dispense”来设置属性    由于BRET信号在添加腔肠后需要几秒才能达到平衡，采取重复读取的所有样本。并且在添加底物后也要执行重复读取，随着时间的推移，可以监测相互作用的稳定性。在监测各种激动剂或者拮抗剂可能对受体-蛋白相互作用的影响的时是特别重要。通过执行重复读取，一个BRET动力学分析正在执行，可以实现实时的监测相互作用。尽管随着时间的推移，发射光的实际数量在减少。阳性对照Rluc-EYFP  BRET融合的BRET比率在添加腔肠后保持至少30分钟恒定，   总结： BRET是一种新型的共振能量转移技术，它代表了一个检测和分析广泛的蛋白质相互作用的有力工具，与目前使用的方法相比具有显着优势。它代表了强大的，单一性的活细胞检测系统，它已经成功的应用于研究受体的相互作用，也非常适合于研究任何蛋白质和蛋白质之间的相互作用。   材料 · 黑色和白色Isoplate 96孔板（25块/包）Perkin Elmer 货号1450-581 · Mithras LB940 多功能酶标仪 · PBS Powder 10 x 1L Gibco（Invitrogen）货号21600-010 · 腔肠（h形式）250ug分子探针货号 C-6780 · EYFP载体-Clontech公司： pEYFP-C1 货号 6005-1，pEYFP-N1 货号6006-1 · Rluc载体-Promega公司：PRL-CMV 货号 E2261    参考文献 1. Eidne, K.A., Kroeger, K.M. and Hanyaloglu, A.C.  (2002) Applications of novel resonance energy transfer techniques to  study dynamic hormone receptor interactions in living cells. Trends. Endocrinol. Metab. 13, 415-421. 2. Xu, Y., Piston D.W. and Johnson C.H. (1999) A  bioluminescence resonance energy transfer (BRET) system: application to  interacting circadian clock proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 151-156. 3.  Zacharias, D.A., Baird, G.S. and Tsien, R.Y.  (2000) Recent advances in technologyfor measuring and manipulating cell  signals. Curr. Opin. Neurobiol. 10, 416-21. 4.  Angers, S., Salahpour, A., Joly, E., Hilairet, S., Chelsky, D., Dennis, M. and Bouvier, M. (2000) Detection of beta 2-adrenergic  receptor dimerization in living cell  using bioluminescence resonance  energy transfer (BRET). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 3684-3689. 5. Kroeger, K.M., Hanyaloglu, A.C., Seeber, R.M.,  Miles, L.E. and Eidne, K.A. (2001) Constitutive and agonist-dependent  homo-oligomerization of the thyrotropin-releasing hormone receptor.  Detection in living cells using bioluminescence resonance energy  transfer. J. Biol. Chem. 276, 12736-12743. 6.  McVey, M., Ramsay, D., Kellett, E., Rees, S.,  Wilson, S., Pope, A.J. Milligan, G.(2001) Monitoring receptor  oligomerization using time-resolved fluorescence resonance energy  transfer and bioluminescence resonance energy transfer. The human delta  –opioid  Application Note receptor displays constitutive oligomerization  at the cell surface, which is not regulated by  receptor occupancy. J.  Biol. Chem. 276, 14092-14099. 7.  Cheng, Z.Y. and Miller, L.J. (2001)  Agonist-dependent dissociation of oligomeric complexes of G  protein-coupled cholecystokinin receptors demonstrated in living cells  using bioluminescence resonance energy transfer. J. Biol. Chem. 276, 48040-48047. 8.  Ayoub, M.A., Couturier, C., Lucas-Meunier, E.,  Angers, S., Fossier, P., Bouvier, M.and Jockers, R. (2002) Monitoring of  ligand-independent dimerization and ligand-induced conformational  changes of melatonin receptors in living cells by bioluminescence  resonance energy transfer. J. Biol. Chem. 277, 21522-21528. 9.  Issafras, H., Angers, S., Bulenger, S., Blanpain,  C., Parmentier, M., Labbe-Jullie, C., Bouvier, M. and Marullo, S. (2002)  Constitutive agonist-independent CCR5 oligomerization and  antibody-mediated clustering occurring at physiological levels of  receptors. J. Biol. Chem. 277, 34666-34673. 10. Ramsay, D., Kellett, E., McVey, M., Rees, S. and  Milligan, G. (2002) Homo- and hetero-oligomeric interactions between  G-protein-coupled receptors in living cells monitored by two variants of  bioluminescence resonance energy transfer (BRET): heterooligomers  between receptor subtypes form more efficiently than between less  closely related sequences. Biochem. J. 365, 429-40. 11. Yoshioka, K., Saitoh, O. and Nakata, H. (2002)  Agonist-promoted heteromeric oligomerization between adenosine A(1) and  P2Y(1) receptors in living cells. FEBS Lett. 523, 147-151. 12.  Lavoie, C., Mercier, J.F., Salahpour, A.,  Umapathy, D., Breit, A., Villeneuve, L.R., Zhu, W.Z., Xiao, R.P.,  Lakatta, E.G., Bouvier, M. and Hebert, T.E. (2002) Beta 1/beta 2-  adrenergic receptor heterodimerization regulates beta 2-adrenergic  receptor internalization and ERK signalling efficacy. J. Biol. Chem. 277, 35402-35410. 13. Hanyaloglu, A.C., Seeber, R.M., Kohout, T.A.,  Lefkowitz, R.J. and Eidne, K.A. (2002) Homo- and hetero-oligomerization  of thyrotropin-releasing hormone (TRH) receptor subtypes. Differential  regulation of beta-arrestins 1 and 2. J. Biol. Chem. 277, 50422-50430. 14. Mercier, J.F., Salahpour, A., Angers, S., Breit,  A. and Bouvier, M. (2002) Quantitative assessment of beta 1- and beta  2-adrenergic receptor homo- and heterodimerization by bioluminescence  resonance energy transfer. J. Biol. Chem. 277, 44925-44931.