摘要 建立了一套通过大肠杆菌表达(H is) 6
2A rg2A rg2人胰岛素原[ (H is) 6
2A rg2A rg2human p ro insulin,
RRhP I]制备重组人胰岛素的工艺。将大肠杆菌中以包涵体形式表达的RRhP I 依次经过DEA E2琼脂糖快流速阴离子交换层析, Sephadex G225 层析, 重组复性酶切转化和Superdex75 分子筛, 制备重组人胰岛素。SDS2PA GE、HPLC、氨基酸组成分析和小鼠惊厥实验结果证明, 制备的重组人胰岛素具有天然生物活性, 而且纯度较高。
关键词 重组人胰岛素 纯化 DEA E2琼脂糖快流速阴离子交换剂 Superdex75
1 引 言
分离纯化是基因工程药物生产中极其重要的一环, 这是由于工程菌经过大规模培养后, 产生的有效成分含量很低, 杂质含量却很高; 另外由于基因工程药物是从转化细胞, 而不是从正常细胞生产的, 因此对产品的纯度要求也高于传统产品。所以要得到合乎医用要求的基因工程药物, 分离纯化要比传统产品困难得多。在重组人胰岛素(Recom b inan t hum anin su lin, rh I) 的基因工程生产中, 同样面临着下游处理非常复杂的问题。为了能有效地纯化目的产物, 目前基因工程生产中普遍使用的是亲合层析和HPLC等手段, 这些分离纯化技术虽然分辨率高, 特异性强, 但十分昂贵。不利于降低成本。为了降低生产成本, 本研究建立了一套由(H is) 62A rg2A rg2人胰岛素原[ (H is) 62A rg2A rg2 hum an p ro in su lin, RRhP I ] 制备重组人胰岛素的下游纯化工艺, 并对产品的性质和纯度进行了鉴定。
2 材料与方法
2. 1 工程菌
RRhP Iö pQ E240 大肠杆菌M 15 菌株。
2. 2 主要试剂
DEA E2琼脂糖快流速阴离子交换剂, Sephadex, Superdex75, 胰蛋白酶和羧肽酶B, 低分子量蛋白, 人胰岛素, 谷胱甘肽(氧化型和还原型),DTT, 其它化学试剂均为国产或进口飞行纯。
2. 3 RRhP I 的初步纯化
DEA E2琼脂糖快流速阴离子交换层析柱用30mmo löL T ris2HCl, 8 mo löL 尿素, pH8. 0 平衡, 包涵体用30 mmo löL T ris2HCl, 8 mo löL 尿素, 50mmo löL DTT , pH 8. 0 溶解后上柱, 用合适的氯化钠梯度进行洗脱, SDS2PA GE 确定RRhP I 组分, 收集含RRhP I 的洗脱液。2. 6 复性及酶切转化将初步纯化后的RRhP I 在Sephadex G225 层析柱上脱尿素, 转换缓冲液进行重组复性, 然后用胰蛋白酶和羧肽酶B 协同酶切将RRhP I 转化为人胰岛素(Hum an in su lin, h I) , 0. 1 mo löL ZnCl2 终止反应并沉淀h I。
2. 4 h I 的纯化
将h I 粗品用30 mmo löL T ris2HCl, 8 mo löL 尿素, pH8. 0 溶解, 在Superdex 75 上进行分离纯化。层析柱的平衡液和洗脱液均为0. 2 mo löL 乙酸钠2乙酸, pH4. 0。
2. 5 HPLC 分析
在HPLC 仪上, 用ODS C18 反相柱(150mm ×6. 0mm ) 进行分析, 流动相为0. 2mo löL(NH4) 2SO 4 溶液(1 mo löL H3PO 4 调pH 至3. 5) 和50%乙腈水溶液按1∶1 (vöv ) 混合而成, 流速1. 0m löm in, 检测波长214 nm , 上样量20 u l。
2. 10 氨基酸组成分析
称样品2. 5 m g, 加6 mo löL HCl 2 m l, 110℃水解24 h, 蒸干后加入2 m l 无离子水溶解, 直接进样,在氨基酸分析仪上进行氨基酸组成分析。
2. 11 h I 整体生物活性的鉴定
按2000 版《中华人民共和国药典》的规定用小白鼠惊厥法鉴定h I 的整体活性。
3 结 果
3. 1 RRhP I 的初步纯化
层析图谱见图1, RRhP I 主要集中在峰2。收集峰2, 进行SDS2PA GE 分析, 见图2。结果显示电泳条带主要集中在13 KD 附近, 峰1 为穿透峰, 此峰中含有p I 高于8. 0 的和一些疏水性的蛋白质, 而绝大部分p I 低于RRhP I 的蛋白质和核酸类杂质牢固地结合在柱子上, 需要较高的盐浓度才能洗脱下来。
表1 是6 次层析的重复实验结果, 可以看出,RRhP I 的回收率较高, 稳定在75%～ 80% 左右。
表1 离子交换层析的RRhP I 回收率
Table 1 RRhP I recovery of DEAE-Sepharrose Fast Flow ionexchange chromatography
Test number (n= 6) RRhP I recovery (% )
1 75. 2
2 77. 0
3 75. 5
4 78. 2
5 79. 6
6 79. 8
x±s 77. 55±1. 81
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