CHO细胞无血清培养入门技术手册
——深圳百恩维生物
1、CHO细胞背景
CHO细胞是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)，1957年美国科罗拉多大学Dr. Theodore T. Puck从一成年雌性仓鼠卵巢分离获得，为上皮贴壁型细胞，是目前生物工程上广泛使用的细胞系。工业生产上应用较多的是CHO-K1细胞，为转化细胞系，细胞染色体分布频率是2n＝22，系亚二倍体细胞。ATCC保存CHO-K1细胞株，编号为CCL-61，被广泛地用于重组DNA蛋白的表达。由于该细胞存在遗传缺陷，无脯氨酸合成基因，不能将谷氨酸转变为谷氨酸-γ-半醛，培养过程中需在培养基中添加L-脯氨酸才能生长。并且由于该细胞已经霍乱毒素适应，形态学有所改变。最初细胞为贴壁型细胞，经多次传代筛选后，也可悬浮生长。
2 、CHO 细胞表达系统的优势与特点
由于哺乳动物细胞结构、功能和基因表达调控的复杂性，外源基因在哺乳动物细胞中的表达与在原核生物中的表达存在较大差异，因而外源基因在哺乳动物细胞中高效表达所需的元件也不同于在原核生物细胞中的表达所需的元件。外源基因在哺乳动物细胞中的表达包括基因的转录、mRNA 翻译及翻译后蛋白质的加工等过程，如蛋白质的糖基化、磷酸化、寡聚体的形成以及蛋白质分子内或分子间二硫键的形成等比较复杂，要表达具有生物学功能的蛋白质如膜蛋白、抗体和具有特异性催化功能的酶需要在哺乳动物细胞中进行。哺乳动物基因表达宿主细胞选择的基本原则是来源丰富、转化效率高、表达效果好，CHO 细胞作为表达系统除具有上述的特点要求外，还有以下优势：
1）外源基因被整合到宿主染色体上后，在没有选择压力的情况下能稳定保持；
2）适合多种蛋白质的分泌表达和胞内表达，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化；
3）对培养基的要求较低，可在无血清培养基中培养；
4）细胞可进行贴壁培养也可进行悬浮培养，且具有较高的耐受剪切力和渗透压能力；
5）可进行高密度大量培养，进行较大规模生产时其培养量可放大到20000L 以上，是目前应用最广泛的哺乳动物基因表达受体细胞之一。
另有研究者尝试将类胰岛素生长因子IGF 基因和转铁蛋白基因转入CHO 细胞获得能自身分泌必需蛋白的“超级CHO”，无需在培养基中转铁蛋白和胰岛素，细胞可在无血清培养基（SFM）中生长良好。
3、CHO细胞无血清无动物源成分培养基
带血清的细胞培养基因为血清的组成具有不确定的性，可控性、重现性都比较差，不利于产业化、规模化。而无血清无动物源培养基组成确定，重现性、可控性都比较好，因此不管是科研客户还是临床治疗客户，越来越趋向于采用无血清无动物源的培养基来培养CHO细胞。目前, 大部分CHO细胞培养均可在无血清培基中进行, 采用无血清培养取代传统血清培养已成为CHO细胞培养的发展必然趋势。无血清培基已广泛应用于细胞生物学、药理学、肿瘤学、细胞工程领域和临床治疗。
深圳百恩维生物依托于在细胞培养基研发和动物细胞大规模培养方面具有丰富经验的研发团队，潜心研究，开发研制了多种个性化培养基，通过在生产实践中的应用已取得可喜的成果，如CHO细胞无血清无动物组分细胞培养基（BW12009）就是其中之一。
4、百恩维CHO细胞无血清培养基（BW12009）的特点
BW12009是深圳百恩维生物开发的新一代CHO细胞无血清无动物组分细胞培养基，能支持多种CHO细胞的生长维持，可广泛应用于CHO细胞的无血清悬浮培养及抗体、重组蛋白、疫苗的生产过程。细胞培养基产品的生产、检验严格执行GMP管理和ISO9001管理体系，符合生物制药原辅料要求，质量稳定可靠。
1）系无血清无动物组分培养基，化学成分明确，保证了细胞培养中原辅料的使用安全性；
2）支持多种CHO细胞系的生长，包括贴附型与悬浮型细胞培养，具有较为广泛的适用性；
3）可维持CHO细胞高密度培养，细胞增殖速度快，适用于实验研究和大规模培养应用；
4）根据用户的不同使用，可定制培养基，以满足各种等不同系统的应用需求；
5）有多种包装规格可供选择，满足不同用户的使用需求。
5、定制CHO 细胞无血清培养基
CHO 细胞存在多种克隆细胞系，ATCC 保存的CHO 细胞就多达38 种，再加上研究单位或百恩维类似的公司构建的细胞，其克隆细胞数量远不止这些。对于CHO细胞无血清培养而言，由于构建的各种高性能CHO 细胞系不同，不同克隆细胞的营养要求也都非常的不同，对营养要求往往是个性化的。另外，CHO 细胞培养过程的不同培养阶段、重组CHO 细胞株的各个阶段，细胞代谢所需的营养或限制因素也是不同的，即同一CHO细胞系在整个培养过程也需要使用不同的培养基，需要与之相对应的个性化培养基。百恩维已经为多家世界著名的生物制药公司提供个性化的CHO 细胞无血清培养基。
6、CHO 细胞无血清驯化
在含血清培养基中生长的 CHO 细胞可经过一定的细胞驯化过程，适应 细胞培养基，进行细胞的无血清培养。百恩维提供已驯化过的CHO 细胞系。如果需要，研究者也可按照以下办法进行CHO 细胞无血清驯化。
已经适应无血清培养的CHO 细胞可直接在BW12009中实现无血清培养培养，建议前二代的细胞密度不低于4×105cells/ml。
细胞的无血清驯化过程如下：
1. 取处于对数生长期的贴壁 CHO 细胞，活率大于95%，开始进行无血清驯化。
2. 细胞驯化可以在方瓶（T-flask）、摇瓶（shake-flask）或转瓶（spinner-bottle）中进行。
3. 将无血清细胞培养基和含血清培养基的按 1：1（V/V）的比例进行混合，接种密度为2－4×105cells/ml 的细胞，在37℃、5％CO2 培养箱进行培养。
4. 根据细胞生长和活率情况，在降血清的每一阶段可稳定传代 1－3 代，接种密度维持在2- 4×105cells/ml。
5. 逐步提高无血清细胞培养基在混合液中的比例（V/V），即降低混合液中的血清含量，传代过程的细胞接种密度仍维持为2- 4×105cells/ml。直至混合液中的血清浓度降低至 0.1-0.2%，每一代的细胞活率大于90％后，此时可将细胞完全培养在CHO 无血清无动物组分培养基中。
6. 在 CHO 无血清无动物组分培养基中进行放大培养，建立起适应无血清无动物组分培养的CHO 种子细胞库。
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