Figure 2 NIR和IR双光子激发和释放光谱。通过在同一焦平面对不同波长的Ti：Sa激光和OPO激光获取多幅图像并对扫描间的能量强度和漂白进行校正后的激发光谱。为获取红色和内在荧光团以及SHG的释放光谱，信号通过物镜，光谱仪和CCD相机检测。 (a) 自然状态下，SDS-PAGE前后的表达细胞质DsRed2 和组蛋白-2B-EGFP的HT-1080细胞.方框表明了光谱获取的区域。(b) EGFP, DsRed2, 和 Alexa Fluor 660的双光子激发光谱.实线代表了SDS-PAGE中分离的蛋白或Alexa Fluor 660，虚线代表了活的双色细胞中的。计算的1100nm对DsRed2的激发效率比760nm要高20倍。(c) 活的非固定的HT-1080双色细胞中830 nm对EGFP和1100 nm对DsRed2的同时激发。 Bars, 20 µm。
从活的双色人纤维肉瘤细胞HT-1080获取的EGFP和DsRed的吸收和激发光谱展示了核EGFP/组蛋白-2B（H2B）和细胞质DsRed，以及从细胞中导出通过电泳分离的分离蛋白。(Figure 2a).据报道，对EGFP最有效的激发波长为930nm，但在1060和1350nm之间没有激发。相对的，DsRed在760nm处有一个小的激发峰，而从1090到1120nm处的激发效率是高于它20倍 (Figure 2b). Alexa Fluor 660表明在1070nm和1300nm间有一个1180nm的强激发峰(Figure 2b).
使用两个不同波长的光束进行成像，它们的焦点必须精确地重合到一起。水平方向的通过对一个参比结构的成像如纵横交叉的胶原纤维的SHG成像调节一束光相对另一束的倾斜来实现。为匹配轴向的焦点位置，将会用到OPO的光束整形设备中的望远镜(Figure 1a, ‘T’).当进行一个滑过均质染料溶液的双光束激发的3D堆栈时，望远镜进行调整直到斜率重叠。 而且，非完全重叠将可能会导致来自不同样品平面的重像。使用EGFP和DsRed2在活的双色HT-1080细胞的同时激发，小的褶皱和核内结构被以非常好的空间分辨率检测到(Figure 2c),确定了IR-MPM在组织活细胞中高分辨率成像的应用。
为同时激发荧光和其它特殊信号如组织结构中释放的SHG，用于混合激发的理想波长被确定。 由于SHG是一个非对称性过程，前向的信后是后向信号的4到8倍；因此，荧光和SHG信号的配准分别通过透镜和聚光器在后向和前向获取。纤维状胶原展示了来自一个输入波长范围最大1100和1189nm的窄的SHG带宽 (Figure 3a). 与NIR在纤维状真皮胶原产生的SHG信号相比，释放光强度比1100nm激发(V Andresen, WM Heupel, P Friedl, unpublished data)的光强5-30倍。SHG对自发荧光的比值大约为500:1(Figure 3b),这超过了Ti：Sa激发的典型比值。因此1100nm是一个适用于同步激发DsRed2，Alexa Fluor 660, 和富含胶原组织的SHG信号的合适OPO波长。
光漂白，光损伤和组织穿透
对于活细胞显微成像，重复暴露在激光下会导致荧光团的光漂白，活性氧中间体的形成和热，最终在成像灵敏度和细胞活性与功能间进行折中。活细胞在1100nm处对DsRed2的光漂白分别低于以880nm和760nm激发的4到10倍 (Figure 4a).在117mw的高激光能量情况下，活细胞中的EGFP和DsRed2分别在500和1700次连续扫描后发生聚集，分别对应760nm和880nm，3和10分钟的连续照明(Figure 4b).作为对照，使用1100nm的激发波长进行104次扫描或60分钟的连续照明时间后没有检测到蛋白的聚集(Figure 4b). 为排除非结构性和潜在的光损伤，由于肌动蛋白驱动的细胞迁移对能量依赖的即时性和对物理化学伤害的敏感性，检测了这一过程。尽管样品被暴露在1100nm的光下超过14小时(Figure 4c)，仍然没有发生细胞迁移或激光诱导的毒性，包括细胞变圆，蛋白质凝集或荧光的损伤。因此，IR-MPM展现了非常低水平的光漂白和光损伤。
Figure 3．IR双光子二次谐波信号(a) 自然状态人皮肤（左）中胶原蛋白丰富区域的SHG光谱（右）。方框，测量区域。(b) 1100nm处人类皮肤的释放光谱。方框表明了角质层，表皮和真皮中获取光谱的区域。纤维状胶原的SHG峰位于激发波长的一半处。
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