LaVision双光子显微镜-多焦点扫描与光激活蛋白在核转运研究中的应用

Multifocal two-photon laser scanning microscopy combined with photo-activatable GFP for in vivo monitoring of intracellular protein dynamics in real time

Joerg Martini a,1, Katja Schmied b,1, Ralf Palmisano b, Katja Toensing a,

Dario Anselmetti a,¤, Thomas Merkle b

a Department of Experimental Biophysics and Applied Nanoscience, Faculty of Physics, University of Bielefeld, 33615 Bielefeld, Germany

b Department of Genomic Research, Faculty of Biology, University of Bielefeld, 33594 Bielefeld, Germany

Received 11 August 2006; received in revised form 20 December 2006; accepted 21 December 2006

Available online 17 January 2007

Abstract

    我们运用多焦点双光子激光扫描显微镜来进行局部和选择性的蛋白激活以及细胞内蛋白动态的的量化调查。局部激活使用光激活绿色荧光蛋白(pa-GFP)和光学双光子激发来实现，以调查实时原位的细胞内动态。这个过程对于深入理解和建模活细胞内的调控和代谢过程极其重要。作为范例，既包含了一个核输入信号又包含了一个核输出信号的拟南芥MYB转录因子LHY/CCA1-like 1 (LCL1)被定量化调查。我们使用了由质粒编码的光激活绿色荧光蛋白(pa-GFP)融合蛋白和一个红色荧光转染标记联合转染的烟草BY-2原生质体，并pa-GFPLCL1在核内光激活后的快速向核外输出。作为对照，一个LCL1核输出阴性突变体仍然被束缚在核内。我们确定了由激活pa-GFP-LCL1的双向核运输和pa-GFP的扩散分别导致的核内荧光下降的51s和125s的平均时间常数

2.材料与方法

2.1.并行的64焦点双光子激光扫描显微镜

    Pa-GFP的激活和荧光的原位检测，通过基于根据蛋白动态监测需求改进的商业化系统(TriM-Scope, LaVision-Biotec; Martini et al., 2005; Nielsen et al., 2001)多焦点2光子LSM检测(Fig. 1). 64焦点2光子LSM (Martini et al., 2006)包括一个倒置光学显微镜和一个可以产生从760nm到960nm的100fs激光脉冲的由固态激光器泵浦的锁模飞秒Ti:Sa激光器。用于激活和成像循环的波长选则通过一个允许5s内转换波长的ahome-built screw motorization来实现。

    激光扫描单元(TriM-Scope, LaVision-BioTec) 包括一个内置的预啁啾部分以补偿激光脉冲的色散，一个光束分光器部分和振镜扫描器。通过选择一组10个100%反光镜和50%分光镜，激发的NIR激光束在样品中被分为1, 2, 4,……, 64个激发焦点。这些数目可调的焦点在显微镜物镜(UPLAO60XW3/IR, NAD1.2;Olympus)的焦平面上被激光扫描单元中的2个扫描镜扫描。整个激活和测量过程在一个温度可控环境中在293±1K下进行。因为在保持每个焦点的能量沉积低于样品的退化极限的同时，多个焦点产生了相对高的双光子诱导荧光产额，成像可以30ms的时间分辨率进行。图像用一个背照明的EMCCD相机(IXON DV887ECS-UVB, Andor Technology)以non-descanned方式获取。激发的NIR激光束被引导通过一个分光镜 (2光子-Beamsplitter, Chroma)到物镜的后光圈上。为了成像深度和光谱荧光切片，倒置显微镜采用了机械聚焦驱动(MFD, Marzhauser)和一个程序控制滤波轮(LaVision-BioTec)。数据获取和实验控制由 TriM Scope的软件包Imspector(LaVision-BioTec)执行。操作和处理5维的数据列，包括光谱和时间数据轴，使用软件包Imspector (LaVision-BioTec)，ImageJ (Rasband, 1997) 或 Imaris (Bitplane).

Fig. 1.多焦点2光子激光扫描显微镜的原理图(1) Tsunami Ti:Sa 激光器(波长可调)由固态Millenia X 激光器泵浦 (均来自 Spectra Physics), (2) 多焦点激光扫描单元 (TriM-scope, LaVision BioTec), (3) 分光镜 (2光子-Beamsplitter, Chroma), (4) 短波通过滤波轮 (2光子-Emitter, Chroma), (5) 物镜 (UPLAO60XW3/IR, NA D 1.2; Olympus), (6) 样品中可选择数目的荧光焦点, (7) 倒置光学显微镜(IX 71, Olympus), (8) 滤波轮 (滤波轮, LaVision BioTec)装备带通滤波片 D 605/55 (Chroma)用于检测 Ds-Red 和 HQ525/50 结合 HQ510/20 (均来自 Chroma)以检测 pa-GFP, (9) 背照式 EMCCD-camera (IXON DV887ECS-UVB, Andor Technology) 在NDD光路中, (10) 荧光灯 (HBO 50, Zeiss), (11) 带通激发滤波轮 D 540/25 (Chroma) 用于 Ds-Red 或带通激发滤波轮HQ 480/20 (Chroma) 用于 pa-GFP.