一、样品的预处理
样品的预处理包括给药、切片或细胞标本的制备。其中给药过程要根据实验目的来进行，在这里主要介绍切片和细胞标本的制备。
1、组织切片样品的处理
其制作过程主要包括组织样品固定、切片制作。组织切片的优点是能够完好地保存细胞间的相互关系和结构，因此是生物医学实验中应用广泛的样品形式。用于共聚焦显微镜测定的切片形式有：活的组织切片、冰冻切片及固定切片。活的组织切片无需固定，活体直接切片后用于观察或测定组织具有活性状态下的一些生理指标。该类切片的缺点是保存条件要求高、时间短，切片比较厚，深层不容易染色。冰冻切片的优点是荧光背景低，引入杂质干扰少，常用于免疫荧光的标记和检测。
2、细胞标本的制备
荧光标记前细胞标本的制备过程包括细胞的培养和细胞的预处理等步骤，细胞的培养和预处理要注意细胞种类和纯度、密度、细胞形态等应符合实验目的。
①细胞种类和纯度实验所选用细胞的种类一般是由实验目或测定指标决定,但是有时会出现细胞种类不纯的现象,杂细胞的干扰会导致错误的实验结果,这种现象在原代分离和培养的细胞中尤为常见。例如原代培养的血管平滑肌细胞中,容易混合有内皮细胞和成纤维细胞:大脑皮层神经元易与胶质细胞相混合,因此实验中应注意签别细胞的种类和纯度,采用相应的方法对细胞进行纯化。
②细胞密度和形态
实验中调整不贴壁细胞和贴壁细胞的细胞密度的方式是不相同的。不贴壁细胞包括直接消化分离的细胞和悬浮生长的细胞,其密度可以通过改变细胞数与溶液体积的比例来调节。
贴壁细胞的密度由其细胞种类、接种密度、细胞铺展面积及间距、细胞增殖速度、生长的时间等来决定。从贴壁细胞的生长方式看,有些是细胞相互连接成片地生长；有些则可以分散成单个细胞生长。要根据实验目的调整细胞接种密度。如果实验目的是对细胞个体进行形态学观察、三维重建、定位荧光信号,则细胞密度可以稀疏一些,这样可以使细胞充分伸展,显示出应有的形态和结构,但也要注意保证显微镜视野内有一定数目的细胞,以便能够观察和统计多个细胞,选取出有代表性的形态结构,反之如果细胞密度过低,细胞数少,则缺少观察过程中的统计意义,而且荧光染色后上机测定时,寻找细胞花费时间太多,激发光长时间照射易引起荧光灭；这就要求细胞所占面积要不低于视野20%。如果实验目的是动态或静态定量测定荧光强度时,则细胞的密度应该高一些,以便做大量细胞的统计定量,细胞约占视野面积的80%,这时观察分散生长的细胞可以看到细胞布满视野但相互间又有空隙、尽量不连成片。无论单个生长还是成片生长的细胞密度不能太高,要保证细胞不聚堆拥挤,以防止细胞相互间荧光互映和挤压变形,影响定量结果。
二、用荧光探针标记样品
标记方式：直接标记，生物样品与荧光探针直接作用，使样品具有荧光。间接标记法：荧光探针将某些特定分子标记，这些特定分子再与细胞作用，使样品具有荧光，如免疫荧光法，荧光标记的药物。显微注射法：利用显微注射向细胞内导入荧光探针，此法得到的荧光细胞少，适合监测少量细胞。膜通透法：利用透膜剂，低渗培养液短期刺激增强探针跨膜能力，从而使探针进入细胞中。
确定荧光探针标记样品的条件：标记探针的浓度，反应温度，时间等。
三、荧光探针标记的注意事项
荧光强度过高：看不清细胞结构细节，不利于形态观察，可降低探针浓度，减少反应时间。
荧光强度弱：荧光探针浓度过低，标记条件不当，探针溶解不充分，探针选择错误等。
在操作过程中，避免对样品造成损伤防止影响实验结果
荧光标记要避光进行。
防止非特异性标记，设立正确的对照组。
荧光标记后要尽快
文章链接：仪器设备网 https://www.instrumentsinfo.com/technology/show-2290.html
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