系统体积被定义为从梯度形成点到色谱柱前端的体积。系统体积用于聚焦梯度的设计。如图1所示，本试验所用仪器配置下的系统体积是3.0 mL。
设计聚焦梯度
第1步
在2.47分钟洗脱3号色谱峰的溶剂浓度在较早的时间点上形成。如图3所示，检测器和梯度形成点之间的偏移量等于系统体积加上柱体积。用于这台特定系统的偏移量等于早期确定的3 mL系统体积再加上19 x 50 mm制备柱的体积（11.9 mL），即14.9 mL。在25 mL/分钟的流速下，溶剂浓度到达检测器需要0.59分钟。2.47分钟的洗脱时间减去0.59分钟的偏移时间等于1.88分钟。由于初始大规模梯度有0.39分钟的保留时间，因此形成洗脱色谱峰的乙腈百分比的时间是1.88分钟减去0.39分钟，即1.49分钟。
第2步
计算在2.47分钟洗脱色谱峰的乙腈百分比。原始大规模梯度在5分钟内洗脱 5-50% B，最初梯度的驻留时间为0.39分钟。
根据在2.47分钟洗脱出色谱峰的梯度计算得到的乙腈百分比是13.4%，但由于梯度开始于5%乙腈，因此洗脱该峰的乙腈实际浓度是13.4% + 5%，或者说18.4%乙腈。
第3步
旨在分离梯度中部洗脱时间接近的色谱峰的聚焦梯度应开始于原始小规模试验条件，通常为0-5% B。进样开始后立即将梯度快速增加至比能洗脱目标峰的预期乙腈百分比浓度低5%的乙腈百分比。在搜索梯度中所用的1/5斜率下继续进行缓的聚焦梯度部分。预计一个五倍的更缓梯度可为洗脱时间接近的色谱峰提供更高的分离度。终止高出可洗脱目标峰的预期乙腈百分比浓度5%的聚焦梯度部分。原始梯度在5分钟内洗脱5-50% B，或者说在5分钟内梯度变化45%。这样，乙腈浓度每分钟变化9%（从9%-10%左右简化得到）。然后，新的梯度斜率应为10%的1/5，或者说每分钟变化2%。10%的乙腈浓度改变通过每分钟变化2%而达到，说明用于分离3号和4号峰的聚焦梯度时间片段应持续5分钟。一旦梯度的聚焦部分完成，乙腈百分比快速增加至95% B，以清洗色谱柱。平衡色谱柱后，终止初始条件下的梯度。5-45% B = 每分钟9%（舍入至每分钟10%）梯度斜率每分钟变化2%。
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