简介

阿尔茨海默病（AD）是典型的老年性痴呆，脑组织内淀粉样蛋白β（Aβ）的累积是造成此病的主要原因，与此同时，患有AD的患者其累积的Aβ90%在脑血管壁上发现。众所周知，Aβ是由可分解出两种蛋白（β-和γ-分泌）的淀粉样前体蛋白（APP）产生的，累积在脑组织内的Aβ分子主要是由神经细胞内的APP表达产生，即APP695.与此相反，另一不同APP即APP770，表达于脑血管内皮细胞，最新报道称，APP770产生的Aβ也在脑血管壁上累积

此ELISA试剂盒用于EDTA-血浆，脑脊髓液和上清中人APP770的检测

实验原理

此试剂盒是一种夹心法的ELISA试剂盒，使用了两种高特异性的抗体。TMB作为显色剂，最终溶液所显示的颜色强度与样品中APP770的量成正比

检测范围

0.10~6.2ng/mL

预期用途

仅用于研究，不能用于诊断

此试剂盒用于EDTA-血浆脑脊液和细胞上清中人APP770的定量检测

试剂盒组成

1.       微孔板，96T，包被有抗人APP OX2(351)兔子IgG抗体，亲和纯化

2.       标记抗体浓缩，30X，0.4ml，HRP标记的抗人APP（R101A4）小鼠IgG 单抗Fab片段

3.       标准品，0.5ml，2支，重组人APP770

4.       EIA缓冲液，30ml，1%的BSA，含0.05%的吐温20的PBS

5.       标记抗体稀释液，12ml，1%的BSA，含0.05%的吐温20的PBS

6.       着色剂，TMB，15ml

7.       终止液，1N硫酸，12ml

8.       洗涤缓冲浓缩液，40X，50ml，0.005%吐温20的磷酸缓冲液

准备步骤

试验所需材料但试剂盒未提供

l         酶标仪（450nm）

l         带刻度的量筒与烧杯

l         孵箱（37℃±1℃）

l         吸水纸

l         稀释试管

l         微量移液器和取样吸头

l         去离子水

l         坐标纸（log/log）

l         用于稀释标准品的试管

l         洗涤瓶

试剂准备

1.       洗涤缓冲液制备：先将洗涤浓缩液平衡至室温，充分混匀，然后吸取50ml浓缩液与1950ml的去离子水混匀，即得。配制的洗涤液应保存于冰箱内，并于2周内用完

2.       标记抗体的制备：用标记抗体稀释液将标记抗体稀释30倍，即得。

例：如果只测一条板，8孔，则需要标记抗体800ul（30ul的标记抗体+870ul的标记抗体稀释液，混匀，使用时每孔加100ul）

此步骤在实验开始前完成

剩余的标记抗体浓缩应装于密封瓶内，保存在4℃

3.       标准品的制备：吸取0.5ml的去离子水至标准品瓶内，充分混匀，得到12.4ng/ml的人APP770标准品

4.       标准品的稀释：准备8个试管用于标准品的稀释，每管加入230ul的EIA缓冲液

每管的浓度如下

1号管                 6.2ng/ml

2号管                 3.1ng/ml

3号管                 1.55ng/ml

4号管                 0.78ng/ml

5号管                 0.39ng/ml

6号管                 0.19ng/ml

7号管                 0.10ng/ml

8号管                 0ng/ml（试验样品空白）

吸取230ul的标准品于1号管混匀，然后从1号管吸取230ul加入2号管，依次连续稀释，标准品范围为6.2~0.10ng/ml

5.       样品稀释：样品用EIA缓冲液稀释。如果样品浓度事先没有评估，我们建议，先用几个不同稀释比例的样品进行检测，来确定样品最佳稀释比例

实验步骤

使用前，所有样品应平衡至室温，大约30min，然后充分混匀，确保试剂质量无变化，标准曲线和样品检测同时进行

1）  确定好空白对照孔，并在相应的微孔中加入100ul EIA缓冲液。

2）  确定好样品对照孔，检测样品孔和标准品孔，然后分别将100ul样品对照品、检测样品和稀释好的标准品加入到相应的微孔中。

3）  盖板，4℃下温育过夜

4）  用洗涤瓶洗板，在微孔中加入洗涤液浸泡15-30秒，弃去洗涤液。重复7次，最后在吸水纸上拍干。如果是用洗板机洗板时，用洗板机洗四次后，再用洗涤瓶洗3次。

5）  每孔加100ul酶标抗体，除试剂空白对照孔外

6）  盖板，37℃下温育30min

7）  按照步骤4）洗板9次

8）  将所需量的显色剂加入到试管中，然后在每一微孔中加入100ul显色剂。为了避免污染，请勿将剩余试剂在倒入原装试剂瓶中。

9）  室温避光温育30min，加入显色剂后溶液颜色会变成蓝色

10）在每孔加100ul终止液，此时溶液颜色会变成黄色

11）擦去微孔板底部的污点或水滴，终止液加入后30min内，在酶标仪450nm处读数

特别注意

1.       试验样品采集后应立即检测或是冻存，冻存的样品避免反复冻融，检测前应在低温下先将其完全溶解混匀

2.       试验样品用EIA缓冲液稀释

3.       试验样品和标准品应做双份检测

4.       试验样品应在中性PH范围，有机溶剂的污染可能会影响检测

5.       只能用试剂盒提供的洗涤液洗板，否则会导致试验失败

6.       吸水纸上拍干微孔板，不能擦拭

7.       TMB底物液应贮存于黑暗处，因其对光敏感，且避免接触金属

8.       加入终止液后30min内必须酶标仪读数

结果计算

绘制曲线前，所有的数据都应减去试验样品空白值，包括标准品和未知的样品。以标准品的OD值和浓度在对数-对数坐标纸上绘制标准曲线，从标准曲线上可直接读取未知样品的浓度

附：采用全自动酶标仪检测，只需检测前设置好酶标仪的相关参数，如坐标参数（线性，半对数）和计算方式参数（三次回归、四参数或双对数曲线方程），即可直接得到结果

本译文仅供参考，详情请以原文为准。