人粒细胞集落刺激因子（G-CSF）ELISA试剂盒使用说明

简介 G-CSF属于细胞因子类，刺激中性粒前体细胞的分化和增殖，它由成纤维细胞和血管内皮细胞产生，且有报道称，在某些肿瘤内可刺激其增殖。人G-CSF试剂盒可检测人G-CSF 原理 此试剂盒根据酶免法的夹心原理，利用两种不同的高特异性抗体，TMB作为着色剂，颜色强度与人G-CSF的量成正比 检测范围 7.81~500pg/ml（37℃下第一次孵育1小时） 1.95~250pg/ml（4℃下第一次孵育过夜）：内部数据 预期用途 1.       此试剂盒用于细胞上清液中人G-CSF的定量检测 2.       重组的和天然的G-CSF都可以用此试剂盒检测 3.       经验表明，由于全血的干扰，血清或EDTA血浆的稀释比例较低可导致结果更低（见附录一） 试剂盒组成 1.       包被板，96孔，包被有抗人G-CSF鼠IgG单抗，亲和纯化 2.       标记抗体浓缩，30X，0.4mlx1，HRP标记的抗人G-CSF兔IgG Fab’，亲和纯化 3.       标准品，1.0mlx2，重组人G-CSF 4.       EIA缓冲液，30mlx1,1%BSA，含0.05%吐温20的PBS 5.       标记抗体稀释液，12mlx1,1%BSA，含0.05%吐温20的PBS 6.       着色剂，15mlx1，TMB底物液 7.       终止液，12mlx1，1N硫酸 8.       洗涤缓冲浓缩液，50mlx1, 40X，含0.05%吐温20的磷酸缓冲液 实验所需材料但试剂盒未提供 1.       酶标仪（450nm） 2.       移液器和枪头 3.       烧杯 4.       蒸馏水 5.       孵箱（37±1℃） 6.       坐标纸（对数-对数） 7.       吸水纸 8.       标准品稀释管 9.       洗瓶 10.   一次性试验管 准备 1.       洗涤缓冲液制备：先将洗涤浓缩液平衡至室温，充分混匀，然后吸取50ml浓缩液与1950ml的去离子水混匀，即得。配制的洗涤液应保存于冰箱内，并于2周内用完 2.       标记抗体的制备：用标记抗体稀释液将标记抗体稀释30倍，即得。 例：如果只测一条板，8孔，则需要标记抗体800ul（30ul的标记抗体+870ul的标记抗体稀释液，混匀，使用时每孔加100ul） 此步骤在实验前完成 剩余的标记抗体浓缩应装于密封瓶内，保存在4℃ 3.       标准品的制备：吸取1.0ml的去离子水至标准品瓶内，充分混匀，得到1000pg/ml的人G-CSF标准品 4.       标准品的稀释：准备8个试管用于标准品的稀释，每管加入230ul的EIA缓冲液 每管的浓度如下 1号管                 500pg/ml 2号管                 250pg/ml 3号管                 125pg/ml 4号管                 62.5pg/ml 5号管                 31.25pg/ml 6号管                 15.63pg/ml 7号管                 7.81pg/ml 8号管                 0pg/ml（试验样品空白） 吸取230ul的标准品于1号管混匀，然后从1号管吸取230ul加入2号管，依次连续稀释，标准品范围为500~7.81ng/ml 内部实验步骤（4℃下孵育过夜） 高灵敏度所必须的操作步骤 1）  标准品的准备：吸取2.0ml的去离子水至标准品瓶内，充分混匀，得到500pg/ml的人G-CSF标准品 2）  标准品的稀释：准备9个试管用于标准品的稀释，每管加入230ul的EIA缓冲液 每管的浓度如下 1号管                 250 pg/ml  2号管                 125pg/ml 3号管                 62.5pg/ml 4号管                 31.25pg/ml 5号管                 15.63pg/ml 6号管                 7.81pg/ml 7号管                 3.91pg/ml 8号管                 1.95pg/ml 8号管                 0pg/ml（试验样品空白） 吸取230ul的标准品于1号管混匀，然后从1号管吸取230ul加入2号管，依次连续稀释，标准品范围为250~1.95pg/ml,9号管为试验样品空白 5.       样品稀释：样品用EIA缓冲液稀释。如果样品浓度事先没有建立，我们建议，先用几个不同稀释比例的样品进行检测，来确定样品最佳稀释比例 实验步骤 使用前，所有样品应平衡至室温，大约30min，然后充分混匀，确保试剂质量无变化，标准曲线和样品检测同时进行 如图： 1.       Reagent Blank孔内加入100ul的EIA缓冲液 2.       将试验样品空白对照，样品和稀释的标准品加100ul至相应的孔内；（内部操作程序一样） 3.       盖板，37℃下孵育1小时（4℃下孵育过夜） 4.       洗板，重复7次以上，吸水纸上拍干；洗板机则洗板4次 5.       每孔加入100ul的标记抗体液，除Reagent Blank孔外 6.       盖板，37℃下孵育30min 7.       洗板9次，同步骤四 8.       吸取试验所需的TMB底物液于一次性试管内，每孔加入100ul的TMB底物液。剩余的TMB底物液不能再放回至原装瓶内，避免污染 9.       黑暗处，室温下孵育30min，溶液变蓝 10.   每孔加入100ul的终止液，溶液变蓝 11.   擦去微孔板底部的污点或水滴，终止液加入后30min内，在酶标仪450nm处读数 特别注意 1.       试验样品采集后应立即检测，冻存的样品避免反复冻融，检测前应先将其完全溶解混匀 2.       试验样品用EIA缓冲液稀释 3.       试验样品和标准品应做双份检测 4.       试验样品应在中性PH范围，有机溶剂的污染可能会影响检测 5.       只能用试剂盒提供的洗涤液洗板，否则会导致试验失败 6.       吸水纸上拍干微孔板，不能擦拭 7.       TMB底物液应贮存于黑暗处，因其对光敏感，且避免接触金属 8.       加入终止液后30min内必须酶标仪读数 结果计算 绘制曲线前，所有的数据都应减去试验样品空白值，包括标准品和未知的样品。以标准品的OD值和浓度在对数-对数坐标纸上绘制标准曲线，从标准曲线上可直接读取未知样品的浓度   附：采用全自动酶标仪检测，只需检测前设置好酶标仪的相关参数，如坐标参数（线性，半对数）和计算方式参数（三次回归、四参数或双对数曲线方程），即可直接得到结果 附录一：  

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