醛固酮ELISA试剂盒使用说明

1、应用范围

此ELISA试剂盒可用于人血清和尿液中醛固酮的定量检测。注：仅供体外诊断用。

2、实验原理

此ELISA试剂盒采用的是典型的竞争法。标准品、质控品和病人样品中的未标记抗原和酶标抗原竞争结合包被板上有限的抗体结合位点。洗板以除去未结合的物质。洗板后，加入酶底物液。最后加入终止液以终止酶反应，并在酶标仪上读取OD值。包被孔中溶液所显示的颜色与样品中醛固酮的量成正比。实验中所用的标准品可作一条标准曲线，我们可以直接从标准曲线上读取样品和质控品中醛固酮的量。

3、临床应用

醛固酮是一种有效的盐皮质激素，这种盐皮质激素的合成和分泌都会受到体内肾素-血管紧张素系统的调控。醛固酮可促进肾远曲小管对钠的重吸收，从而可以保钠排钾，进而控制循环血溶量。醛固酮长期分泌过多会引起高血压。血清醛固酮的检测加上血浆肾素水平的检测通常都用来区分原发性和续发性醛固酮增多症。

醛固酮的检测再加上选择性抑制和刺激实验，我们可以将原发性醛固酮增多症分为两种基本类型：

1）由肾上腺瘤（一个或两个）引起的原发性醛固酮增多症。

2）由肾上腺增生引起的原发性醛固酮增多症。

这种分类对于疾病的治疗与处理具有重要作用。肾上腺瘤一般对外科手反应良好，而肾上腺增生在医学上更好处理。总得说来，用ELISA方法精确检测血清醛固酮是高血压鉴别诊断的一个重要辅助工具。

4、样品的采集与储存

血清：进行一次双份检测大概需要0.2ml血清。采集4-5ml血液到相应的标记试管中，并待其凝血，离心获取血清。4℃下可稳定存放24个小时，如果实验过几天再做，可将样品冻存-10℃的环境或更低温度下。

尿液：进行一次双份检测大概需要0.2ml尿液。将24小时尿液收集到相应的样品容器中。4℃理可稳定存放24小时，如果实验过几天再做，可将样品冻存于-10℃或更低温度的环境下。将所有的人样品都当作潜在的生物有害物质，处理时应当特别小心。

5、样品预处理

血清：此检测系统是一直接检测系统，不需要进行任何样品预处理。

尿液：使用前用尿液稀释液按1：50的比例稀释尿液样品。例如：用1ml尿液稀释液稀释20μl尿液样品。

6、实验所需器材但试剂盒不提供

1）移液器，50；100；150和300μl

2）取样吸头

3）蒸馏水或去离子水

4）摇床

5）酶标仪

6）尿液稀释液（如果用尿液样品做实验，就得稀释样品），用于尿液样品的稀释。

7、试剂盒成份

1）兔抗醛固酮抗体包被的可拆包被板，即用。内含：抗醛固酮抗体包被的96孔包被板，密封于含干燥剂的包半装袋中，储存：冷藏于2-8℃的环境下，稳定性：12个月或标签上的有效期。

2）HRP标记的醛固酮酶联物，50倍浓缩型，内含：HRP标记的醛固酮酶联物、蛋白缓冲液和无汞防腐剂，体积：300μl/支，储存：冷藏于2-8℃的环境下，稳定性：12个月或标签上的有效期，制备：使用前用检测缓冲液按1：50的比例进行稀释（例如：40μl HRP酶联物中加入2ml检测缓冲液。如果整个包被板都使用，可以用12ml检测缓冲液稀释240μl HRP酶联物，弃去剩余试剂。

3）醛固酮标准品，即用。6支，内含：醛固酮、人血清白蛋白和无汞防腐剂，用血清和一定量的醛固酮制备而成。下表为标准品的大概浓度，具体浓度请见试剂瓶标签：

储存于2-8℃的环境下，稳定性：12个月或标签上有效期，一旦打开，所有的标准品都必须在14天内用完或将其冻存，避免反复冻融。

4）质控品，即用，1支，内含：醛固酮、人血清白蛋白和无汞防腐剂，用缓冲液和一定量的醛固酮制备而成，具体浓度及可接受范围请见试剂瓶标签。体积：0.6ml/支，储存：冷藏于2-8℃的环境下，稳定性：12个月或标签上的有效期，一旦打开，所有的质控品都必须在14天内用完，必免反复冻融。

5）浓缩冼涤液，10倍浓缩型，1支，内含：缓冲液、非离子型去垢剂和无汞防腐剂，体积：50ml/支，储存：冷藏于2-8℃的环境下，有效期：12个月或标签上的有效期，制备：使用前用蒸馏水或去离子水按1：10的比例进行稀释，如果整个包被板都使用，可用450ml蒸馏水稀释50ml浓缩冼涤液。

6）检测缓冲液，即用，1支，内含：蛋白缓冲液和无汞防腐剂，体积：15ml/支，稳定性：12个月或标签上的有效期。

7）TMB底物液，即用，1支，内含：TMB、过氧化氢和非DMF或DMSO，体积：16ml/支，储存：冷藏于2-8℃的环境下，稳定性：12个月或标签上的有效期。

8）终止液，即用，1支，内含：1M的硫酸，体积：6ml/支，储存：冷藏于2-8℃环境下，稳定性：12个月或标签上的有效期。

8、实验步骤

样品预处理：

血清：无

尿液：使用前用尿液稀释液按1：50的比例进行稀释。

使用前必须将所有的试剂都平衡到室温，标准品、质控品和样品都必须作双份检测，一旦实验开，所有的步骤都必须完整的进行下去。

1）制备好即用型的HRP酶联物和检测缓冲液。如果用尿液作实验，应将尿液稀释好。

2）取出所需数目的板条，将不用的板条重新密封于包装袋中并冷藏。

3）将标准品、质控品和样品（血清或已稀释好的尿液）分别50μl加入到相应的微孔中（双份检测）

4）在每一微孔中加入100μl酶联物（建议您使用多道移液器）。

5）室温环境下，在包被板摇床上（200rpm）温育1个小时。

6）每孔用300μl洗涤液洗板3次，并在吸水纸上拍干。

7）以相同的时间间隔，在每一微孔中加入150μl TMB底物液。

8）室温环境下，在包被板摇床上温育15-20分钟。

9）在每一微孔中加入50μl终止液。

10）加终止液后20分钟内450nm处读取OD值。

*如果OD值超过450nm滤光片的检测上限，我们可用405n或415nm代替，OD值可能会比较低，但它并不会影响样品和质控品的实验结果。

9、结果计算

1）计算两个标准品OD值的平均值。

2）在半对数坐标纸上，以平均OD值为Y轴、标准品的浓度为X轴作一条校准曲线。如果使用免疫检测软件，我们可以作四参数曲线。

3）计算每一未知样品OD值的平均值。

4）直接从标准曲线上读取样品的浓度。

5）将获得的样品浓度值乘以稀释因子。然后乘以24小时尿液的体积，从而其闪单位可变为pg/24小时。最后将pg/24小时除以10⁶，相应的单位就变成μg/24小时。

6）如果血清样品浓度高于1000pg/ml,我们可以用标准品A将其进行稀释（但稀释比例不高于1：8）。则其结果应乘以相应的稀释因子。如果尿液样品的浓度高于1000pg/ml，我们可以用尿液稀释液对其进行稀释（但稀释比例不能高于1：2），最后其结果也应当乘以相应的稀释因子。

转换因子：

pg/ml×2.744＝pmol/L        pmol/L=nmol/L×1000

10、参考值

正常血清参考值

对于所有的临床检验来说，每个实验室都应收集数据并建立自己的正常值范围：

正常尿液参考值

对于所有的临床检验来说，每个实验室都应收集数据并建立自己的正常值范围：

本译文仅供参考，详情请以原文为准。