7、实验所需器材（但试剂盒不提供）
1）移液器（10；10-100；100-1000μL）
2）轨道摇床（200-900rpm）
3）旋涡混合器
4）带储器的8通道移液器
5）洗涤瓶，自动或半自动包被板清洗系统
6）酶标仪
7）双蒸水或去离子水
8）吸水纸，取样吸头，计时器
9）样品稀释用试管。
8、手动操作
8.1实验前说明
注意 | 用于96人份检测色试剂盒成分可分成两次进行。下列所述体积为做48人份时所需要的量。 |
注意 | 试剂盒中的质控品和所有尿液样品在使用前都必须在试管中用0.1M的HCl按1：5的比例进行稀释（例如：20μL尿液+80μL 0.1M的HCl）。标准品无需稀释。 |
8.2样品的稀释
如果样品中多巴胺浓度高于最高标准品的应按照下列所述进行稀释：
样品 | 待稀释 | 稀释液 | 备注 |
血浆 | 多巴胺浓度高于最高标准品中多巴胺的浓度 | 双蒸水 | 提取步骤前 |
尿液 | 多巴胺浓度高于最高标准品中多巴胺的浓度 | 0.1N的HCl | 提取步骤前 |
8.3样品、标准品和质控品的提取（提取板）
1） | 将标准品、已稀释好的质控品、已稀释好的尿液样品各20μL和500μL血浆样品加入到提取板相应的微孔中。除血浆样品孔外，在所有的微孔中加入500μL双蒸水以消除体积差别。 |
2） | 在每一微孔中加入1000μL提取缓冲液 |
3） | 盖板。在轨道摇床（600-900rpm）上18-25℃的环境下提取30min。在提取过程中，液体的表面应该会浸湿粘性金属板，但液体的量不能超过微孔的2/3。液体是否溅出并不会影响实验结果。 |
4） | 移去粘性金属板，快速弃取孔内反应液，在吸水纸上拍干。 |
5） | 每孔加入2ml双蒸水 |
6） | 用新的粘性金属板盖板。在轨道摇床上（600-900rpm）18-25℃的环境下振荡5min。液体是否溅出并不会影响实验结果。 |
7） | 移去粘性金属板，快速弃取孔内反应液，在吸水纸上拍干。 |
8） | 每孔加入150μL提取缓冲液，再向每孔中加入50μL酰化试剂，立即混合均匀。 |
9） | 在轨道摇床（400-600rpm）上18-25℃的环境下提取20min。（无需盖板） |
10） | 快速弃取孔内反应液，在吸水纸上拍干。 |
11） | 每孔加入2ml双蒸水。 |
12） | 用新的粘性金属板盖板。在轨道摇床上（600-900rpm）18-25℃的环境下振荡5min。液体是否溅出并不会影响实验结果。 |
13） | 移去粘性金属板，快速弃取孔内反应液，在吸水纸上拍干。 |
14） | 每孔加入300μL Release缓冲液。 |
15） | 在轨道摇床（400-500rpm）上18-25℃的环境下振荡30min。（无需盖板） |
已准备好的样品应当在当天就进行检测。如果不行的话，您可将提取板用粘性金属板盖好，在2-8℃的环境下可存放一夜。
8.4冻干粉或浓缩成分的准备
稀释 | 成分 | 稀释液 | 比例 | 备注 | 贮存 | 稳定性 | |
25ml | 洗涤液 | 225ml | 双蒸水 | 1:10 | 充分混合 | 2-8℃ | 4W |
60μL | 酶联物 | 6ml | 洗涤缓冲液（已稀释好） | 1:101 | 临时配置，仅能使用一次，混合时避免气泡产生 | 18-25℃ | 5h |
4 | PNPP底物片 | 10.7ml | PNPP底物液 | 临时配置，仅能使用一次 | 18-25℃ | 5h |
9、实验步骤（手动操作）
9.1 COMT酶溶液的准备
注意：COMT酶溶液应在使用前直接临时配置 |
在COMT冻干粉中加入1.25ml双蒸水，充分混和。再加入1.25ml酶联溶液，然后再加入1.25ml酶溶液和0.40ml COMT添加剂以充分混合溶解的COMT试剂*，COMT酶溶液最后的体积为每支4.15ml。一支可做48人份。溶液可用旋涡混合器混合，但要避免气泡产生，配置好的COMT溶液可在室温下稳定存放1小时。 |
*如果只需要一定量的COMT溶液，则剩余的COMT溶液应立即冻存于-20℃的环境下。COMT溶液可在此环境下稳定存放1-2个月。
9.2样品、标准品和质控品的酶化
注意 | 如果使用自动置换型移液器，请将取样吸头内的残余液体加回到提取板相应的微孔内。将提取板置于一斜坡位置比较适当。 |
科研用组织匀浆和细胞培养上清可按如下建议处理：细胞培养上清必须根据其培养基及其相应浓度进行处理：根据尿液样品的操作说明（至少提取20ul上清液），未稀释样品的灵敏度大概为1.0ng/ml。如果基质内添加了血清（FCS），血浆（至少提取500ul上清）操作的灵敏度可以是5pg/ml。无高氯酸的组织匀浆可用做匀浆样品，具体信息请咨询IBL汉堡公司。
9.3检测尿液和血浆中的多巴氨
1 | 在包被板的每一微孔中加入75μL刚配置好的COMT酶溶液，轻轻振荡。 |
2 | 在尿液样品、标准品和质控品的微孔中加入90μL Release缓冲液（血浆样品孔除外）。将已提取好的标准品、质控品和尿液样品分别10μL加入到相应的微孔中。将100ul提取好的血浆样品加入到相应的微孔中。在此加样步骤中，可直接将取样吸头伸入到COMT溶液中。溶液颜色变成粉色，轻轻振荡。 |
3 | 在每一微孔中加入50ul多巴胺抗血清（紫色）。 |
4 | 盖板，在振荡器（400-600rpm）上室温（18-25℃）温育120min |
5 | 移去粘性金属板，弃取孔内反应液，每孔用250-300μL已稀释好的洗涤液洗板6次。吸水纸上拍干以除去残余液体。 |
6 | 在每一微孔中加入100ul临时配置好的酶联物。 |
7 | 盖板，在振荡器（400-600rpm）上室温（18-25℃）温育60min |
8 | 移去粘性金属板，弃取孔内反应液，每孔用250-300μL已稀释好的洗涤液洗板6次。吸水纸上拍干以除去残余液体。 |
9 | 如果可以的话，使用8道移液器加底物液和终止液。加底物液和终止液的时间间隔应当相同，使用自动置换型移液器并避免气泡产生。 |
10 | 在每一微孔中加入200ul底物液。 |
11 | 在振荡器（400-600rpm）上室温（18-25℃）温育40min |
12 | 在每一微孔中加入50ul PNPP终止液，轻轻振板以使溶液混合均匀。 |
13 | 加终止液后60min内405nm处读取OD值。（参考波长：620-650nm） |
10、自动操作步骤
10.1实验前说明
注意 | 用于96人份检测色试剂盒成分可分成两次进行。下列所述体积为做48人份时所需要的量。 |
注意 | 试剂盒中的质控品和所有尿液样品在使用前都必须在试管中用0.1M的HCl按1：5的比例进行稀释（例如：20μL尿液+80μL0.1M的HCl）。标准品无需稀释。 |
10.2样品的稀释
如果样品中多巴胺浓度高于最高标准品的应按照下列所述进行稀释：
样品 | 待稀释 | 稀释液 | 备注 |
血浆 | 多巴胺浓度高于最高标准品中多巴胺的浓度 | 双蒸水 | 提取步骤前 |
尿液 | 多巴胺浓度高于最高标准品中多巴胺的浓度 | 0.1N的HCl | 提取步骤前 |
10.3样品、标准品和质控品的提取（提取板）
1） | 将标准品、已稀释好的质控品、已稀释好的尿液样品各30μL和750μL血浆样品加入到提取板相应的微孔中。除血浆样品孔外，在所有的微孔中加入750μL双蒸水以消除体积差别。 |
2） | 在每一微孔中加入1000μL提取缓冲液 |
3） | 盖板。在轨道摇床（600-900rpm）上18-25℃的环境下提取30min。在提取过程中，液体的表面应该会浸湿粘性金属板，但液体的量不能超过微孔的2/3。液体是否溅出并不会影响实验结果。 |
4） | 移去粘性金属板，快速弃取孔内反应液，在吸水纸上拍干。 |
5） | 每孔加入2ml双蒸水 |
6） | 用新的粘性金属板盖板。在轨道摇床上（600-900rpm）18-25℃的环境下振荡5min。液体是否溅出并不会影响实验结果。 |
7） | 移去粘性金属板，快速弃取孔内反应液，在吸水纸上拍干。 |
8） | 每孔加入150μL提取缓冲液，再向每孔中加入50μL酰化试剂，立即混合均匀。 |
9） | 在轨道摇床（400-600rpm）上18-25℃的环境下提取20min。（无需盖板） |
10） | 快速弃取孔内反应液，在吸水纸上拍干。 |
11） | 每孔加入2ml双蒸水。 |
12） | 用新的粘性金属板盖板。在轨道摇床上（600-900rpm）18-25℃的环境下振荡5min。液体是否溅出并不会影响实验结果。 |
13） | 移去粘性金属板，快速弃取孔内反应液，在吸水纸上拍干。 |
14） | 每孔加入450μL Release缓冲液。 |
15） | 在轨道摇床（400-500rpm）上18-25℃的环境下振荡30min。（无需盖板） |
已准备好的样品应当在当天就进行检测。如果不行的话，您可将提取板用粘性金属板盖好，在2-8℃的环境下可存放一夜。
10.4冻干粉或浓缩成分的准备
稀释 | 成分 | 稀释液 | 比例 | 备注 | 贮存 | 稳定性 | |
25ml | 洗涤液 | 450ml | 双蒸水 | 1:10 | 充分混合 | 2-8℃ | 4W |
150μL | 酶联物 | 15ml | 洗涤缓冲液（已稀释好） | 1:101 | 临时配置，仅能使用一次，混合时避免气泡产生 | 18-25℃ | 5h |
4 | PNPP底物片 | 10.7ml | PNPP底物液 | 临时配置，仅能使用一次 | 18-25℃ | 5h |
11、实验步骤（自动操作）
11.1 COMT酶溶液的准备
注意：COMT酶溶液应在使用前直接临时配置 |
在COMT冻干粉中加入1.25ml双蒸水，充分混和。再加入1.25ml酶联溶液，然后再加入1.25ml酶溶液和0.40ml COMT添加剂以充分混合溶解的COMT试剂*，COMT酶溶液最后的体积为每支4.15ml。一支可做48人份。溶液可用旋涡混合器混合，但要避免气泡产生，配置好的COMT溶液可在室温下稳定存放1小时。 |
*如果只需要一定量的COMT溶液，则剩余的COMT溶液应立即冻存于-20℃的环境下。COMT溶液可在此环境下稳定存放1-2个月。
11.2实验步骤
在使用自动方法做实验时，我们建议按1：10的比例预先稀释提取好的标准品、质控品和尿液样品（如果是手动操作则用Release缓冲液进行稀释）。如果稀释了，第二个步骤可简化为：将已提取好的血浆样品、已提取好的标准品（按1：10的比例预先稀释）、质控品和尿液样品各100μL加入到微孔中。在进行预稀释时，应当考虑到自动操作的死容积。
1） 在包被板的每一微孔中加入75μL刚配置好的COMT酶溶液，轻轻振荡。
2） 在尿液样品、标准品和质控品的微孔中加入90μL Release缓冲液（血浆样品孔除外）。将已提取好的标准品、质控品和尿液样品分别10μL加入到相应的微孔中。在此加样步骤中，可直接将取样吸头伸入到COMT溶液中。溶液颜色变成粉色，轻轻振荡。
3） 每孔中加入50μL多巴胺抗血清。
4） 盖板。在振荡器（400-600rpm）上18-25℃的环境下温育120min
5） 弃取孔内反应液，每孔用250-300μL已稀释好的洗涤液洗板6次。
6） 每孔加入100μL酶联物
7） 盖板。在轨道摇床（400-600rpm）上18-25℃的环境下温育60min
8） 弃取孔内反应液，用250-300μL已稀释好的洗涤液洗板6次。
9） 加底物液和终止液时，其时间间隔应相同
10） 每孔加入200μL底物液
11） 在轨道摇床（400-600rpm）上18-25℃的环境下温育40min。如果自动操作时的温度超过25℃时，则应相应的将温育时间缩短至30min。
12） 每孔加入50μL PNPP终止液以终止底物反应，轻轻振荡包被板以充分混合试剂成分。
13） 加终止液后60min之内405nm处读取OD值。（参考波长：620-650nm）
12、期望值
实验结果不能当作判断任何治疗结果的唯一因素，疾病的判断还应当与其它临床观察和诊断检测相结合。以下结果为正常人群的正常值（5%-95%），建议每个实验室读确定自己的正常值范围：
尿液 | 血浆 | |||
μg/d | nmol/d | pg/mL | nmol/L | |
多巴胺 | ＜600 | ＜3917 | ＜100 | ＜0.65 |
本译文仅供参考，详情请以原文为准。
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