生物样本冷冻储存技术（二）

程序降温/分步降温（programmed freezing/stepwise freezing）

    通过控制样本的降温速度可以尽量减少冰晶损伤和溶液损伤。降温速度的控制可通过在不同的温度下分阶段降温（stepwise freezing）或者程序控制降温（programmed freezing）实现。与分步降温相比，程序降温仪通过时时调节往冻存空间喷放液氮的流量能更精准地控制样本本身的降温速度。比如在0—-5⁰C液体样本转变为固体发生相变时会产生热量，引起样本的回温，造成样本额外伤害。程序降温仪能够在相变时加大降温力度避免这一伤害。程序降温仪在冻存精子、卵子、受精卵、干细胞、皮肤等样本中得到了广泛的应用，全球大约有30-40万体外受精的婴儿使用了这一方法。一个冻存程序通常包括慢冻、快冻等几个阶段，在冻存保护剂存在的情况下常见的冻存速度慢冻0.3-1.5⁰C/分钟,快冻5-8⁰C/分钟。在0～-40⁰C的区间不少程序使用的是慢冻。但具体的降温程序随冻存样本的不同可能有较大的差别。

玻璃化冷冻（Vitrification）

    玻璃化冷冻的理论首先由Luyet提出。液体的凝固可分为两种形式：一种是晶体化，溶液中的分子呈有序排列；另一种情况是非晶体即玻璃化，液体中的分子呈无序状态，保持未凝固前的状态。 正常冷冻时水容易在细胞内形成晶体造成晶体损伤，在细胞外形成晶体造成溶液损伤。但在超快速玻璃化冷冻的条件下细胞内外均呈玻璃化凝固，无冰晶形成或仅形成很小的冰晶，不致对细胞膜和细胞器不致造成损伤，细胞也不会在高浓度的溶质中长时间暴露而受损。但玻璃化冷冻所需要的超的高速降温很难在常规实验条件下实现。1981年Fahy提出用高浓度的冷冻保护液（玻璃化溶液）的方法大大降低了对降温速度的要求，并与1985年由Rail和Fahy完成鼠胚的玻璃化冻存，实现这一技术的使用突破。

    玻璃化冷冻是一种较新的技术，适合用于一些常规程序降温难以处理的样本，比如复杂的组织和器官。但对于常规程序降温能够较好处理的样本（如细胞和体积很小的组织），这一技术还没有展现出特别的优势。正常的水的玻璃化冷冻需要极快的速度，是常规实验室难以实现的。为了降低组织的玻璃化降温要求，需要在样品中加入高浓度的冷冻保护剂，常用的浓度约在40％～60％(W／V)。即使是几分钟的时间也会对细胞和组织会带来明显的伤害。所以虽然玻璃化冷冻减少了冷冻过程的冰晶伤害和溶液伤害，但在一些对比试验并没有表现出更好的效果，反倒是其复杂的操作带来了不便。目前在玻璃化冷冻中，降低冷冻保护剂损伤的方法主要是使用不同冷冻保护剂的混合物和阻冰剂（ice blockers）。通过这一改进，Twenty-First Century Medicine成功将冷冻并化冻的兔肾移植到兔子体内并保持了正常功能。

急冻（Snap freezing）

    急冻法通常用于保护纯化的生物大分子，或者为了将来提取生物大分子的组织样本。做法是将样本直接放入液氮中，短时间处理之后转移至超低温冰箱或更低的温度环境储存。比较常见的例子是冷冻用于将来提取核酸的组织。这种做法会损伤大部分细胞和精细组织结构，不能用于保存样本内细胞和组织的活性。

3 冷冻保护剂

    冷冻保护剂是指可以保护细胞和组织微观结构免受冷冻损伤的物质，通常配成一定浓度的溶液。细胞悬液中加入冷冻保护剂可保护细胞免受溶液损伤和冰晶损伤。冷冻保护剂同溶液中的水分子结合，发生水合作用，弱化水的结晶过程使溶液的粘性增加从而减少冰晶的形成．同时冷冻保护剂可以通过在细胞内外维持一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤。通常只有红细胞、大多数微生物和极少数有核的哺乳动物细胞悬浮在不加冷冻保护剂的水或简单的盐溶液中，并以最适的冷冻速率冷冻，可以获得活的冻存物。但对于大多数有核哺乳动物细胞来说，在不加冷冻保护剂的情况下，无最适冷冻速率可言，也不能获得活的冷冻物。例如将小鼠骨髓细胞悬浮在不加冷冻保护剂的平衡盐溶液中，并以0.3～600⁰C/min的冷冻速率降温冷冻，98%以上的细胞会死亡；而加入甘油冷冻保护剂进行冷冻保存时，98%以上的细胞都可存活。

    冷冻保护剂根据其是否穿透细胞膜可分为渗透性和非渗透性两类。渗透性冷冻保护剂多是一些小分子物质，可以透过细胞膜渗透到细胞内。该类保护剂主要包括二甲基亚砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤同时，细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。目前使用较多的是DMSO、甘油、乙二醇和丙二醇等。DMSO对细胞的渗透较快，冻存过程中保护效果较好，使用比较普遍，常用浓度是5%-10%。但DMSO本身对细胞有明显的伤害，在4⁰C的温度下伤害尤甚，因此不建议样本添加DMSO后在此温度下长时间放置，通常与程序降温仪或梯度降温盒配合使用实现温度连续匀速降低。

    非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是些大分子物质，主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羟乙基淀粉等。其保护机制的假说很多，其中有一种可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物质可以优先同溶液中水分子结合，降低溶液中自由水的含量，使冰点降低，减少冰晶的形成；同时，由于其分子量大，使溶液中电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤。

    不同的冷冻保护剂有不同的优缺点。目前的趋势是联合使用两种以上冷冻保护剂组合。由于许多冷冻保护剂在低温条件下保护细胞，在常温下对细胞有害。故在细胞复温后要及时清除冷冻保护剂。