摘 要：RFLP是随着生物技术若干领域的发展而产生的一种分子标记技术, 用该技术可作出 植物的RFLP图谱，并应用于植物遗传和育种研究。本文简单的对RFLP技术的基本原理、技术 步骤及其优缺点作了简单的概况。
关键词： RFLP；作物研究；应用
中图分类号： S5．032 文献标识码：A 文章编号： 1008-7508（ 2007）03-0105-03
一、基本原理
限制性核酸内切酶（restriction end nuclease）能够识别DNA双链上特异的碱基序列并能 将之切断。不同的限制性核酸内切酶有各自特异的识别序列。在同源染色体相应的DNA区段 ，用一种限制性核酸内切酶消化，由于碱基组成不同，就会产生不同长度的酶切片段，然后 用标记好的相应的DNA探针与这些片段杂交，显示出的图谱就可以反映出基因组DNA碱基序列 组 成是否存在差异。这一技术的基础是通过限制性核酸内切酶切片段长度多态性来揭示DNA碱 基序 列组成的异同，因而称为限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorp hism，缩写为RFLP）技术。
二、RFLP技术的基本步骤
这一技术主要包括三大步骤：
1、靶DNA的准备 先将基因组DNA抽提出来，选用合适的限制性核酸内切酶酶解基因组DNA， 将酶解出来的具有各种长度的DNA片段在琼脂糖凝胶电泳分离，使其按片段的长短排列，将D NA片段变性后转移至硝酸纤维膜或尼龙膜上，称印迹（Southernb1ot）转移，并在80℃烘烤 或用长波紫外线照射，将DNA固定在膜上。
2、核酸探针的标记 将准备作为探针的DNA片段纯化（这些DNA片段可以是基因组DNA的 一个片段，或是cDNA，或是人工合成的寡核苷酸），用放射性元素（如α－32p）或非放射 性元素（如Dig－dUTP等）标记，经纯化后再用。
3、杂交显示 将标记好的探针与硝酸纤维膜或尼龙膜上的单链核酸杂交，洗膜去除未杂交 的标记探针后，进行放射自显影或加入酶的底物进行显色反应，再对显示出来的谱带进行分 析。
三、RFLP技术的优点及注意的问题
1、RFLP技术的优点
第一，标记数目可以是无限的：RFLP揭示的是DNA水平自然变异，其数目几乎是无限的。
第二，大部分标记为共显性：表现RFLP的位点一般是单一序列，每个位点通常有两个等位基 因(其显性)。遵循孟德尔式遗传，因而RFLP标记图也可用传统的基因标图方法来构建。
第三，任何生育期都可预测，不受环境影响：DNA分子水平标记没有发育阶段或器官的特异 性，不受环境条件及基因互作的影响。
第四，高度变异性：每一植株都会有大量的多态性。通常只要有一次有性杂交，一个作图群 体就能构建一个较丰富的RFLP图谱。
2、在做RFLP分析技术时，有几个问题是需要引起密切注意：
第一，作为检测对象的DNA分子必须保持大分子，在抽提DNA的过程中避免人为地将DNA分子 机械性切割成小片段的DNA，否则最终显示的RFLP图谱可能是一种假象；
第二，在用限制性内切酶消化大分子DNA时，要使DNA被完全消化，否则所得的结果也不可靠 ；
第三，被消化的DNA浓度不能太高；
第四，电泳时要用低压电泳；
第五，杂交前探针必须充分变性；
第六，要根据探针标记的情况以及探针与靶DNA间序列互补的程度和G、C的含量来掌握杂交 和洗膜的条件；
第七，作放射自显影时，要根据杂交后膜上的放射活性等因素决定曝光的时间。
首页
