原代细胞中期染色体的分离

试剂和器材： 
1. 秋水仙胺；
2. 2-甲-2，4-戊二醇缓冲液：1mol/L 2-甲-2，4-戊二醇、0.5mmol/L CaCl^₂、0.1mmol/L Pipes-NaOH，pH6.8；
3. 梯度溶液：用2-甲-2，4-戊二醇缓冲液配制成280g/L、580g/L和600g/L的Nycodenz○R；
4. 二甲基二氯硅烷（10g/L浓度溶于四氯化碳中）；
5. 低速离心机与高速离心机；
6. 高速离心机，配吊桶式转子；
7. 用于吊桶式转子的15ml Corex管；
8. 23号注射器，带金属套管针；
9. 相差显微镜；
10. 双室梯度仪或者Gradient MasterTM；

实验方法：
1. 用二甲基二氯硅烷处理Corex管5min，然后60℃烘烤24h；
2. 向培养基中添加6×10-5g/ml的秋水仙胺，使培养原代细胞停滞在细胞分裂的中期，并孵育3h；
3. 轻轻振摇以选择性分离中期细胞，对分离的原代细胞4℃预冷20min，300g离心5min使之沉淀；
4. 用2-甲-2，4-戊二醇缓冲液重悬原代细胞并洗涤，之后再沉淀细胞（同步骤3）；
5. 以相同的缓冲液重悬细胞（细胞浓度应小于2g/L），37℃孵育10min，用23号注射针抽吸细胞悬液数次以裂解细胞，通过相差显微镜观察监视裂解过程；
6. 2000g离心10min以沉淀染色体；
7. 在处理过的Corex管中用等体积的280g/L和580g/L Nycodenz○R制备10ml梯度溶液，并将用600g/L Nycodenz○R悬浮的染色体沉淀放置于管底；
8. 16300g离心10min，染色体带（密度约为1.23g/ml）大约处于梯度的2/3位置；
9. 原代细胞中期染色体可以通过显带法染色；