人衰老成纤维细胞经紫外线损伤后的DNA 修复和细胞周期调控
摘要 以体外培养的不同代龄的人胚肺二倍体成纤维细胞(2BS) 为对象, 紫外线诱导DNA 损伤后, 观察细胞形态、增殖特性、细胞周期、DNA修复变化等细胞应答以及gadd153、p21、p53 等基因的转录水平的表达变化. 结果显示: 紫外线诱导DNA损伤后, 衰老(>55代) 2BS 细胞形
态及增殖能力的改变不如年轻细胞(<30代) 显著; 不同代龄的细胞损伤后均出现G1 期阻滞现象, 年轻细胞G1 期阻滞率明显高于衰老细胞(P<0105) ; 衰老细胞总的修复能力较年轻细胞明显下降(P<0101) ; 同时, gadd153、p21、p53 等的可诱导性均低于年轻2BS 细胞. 由此, 分别在细胞水平与基因水平反映了衰老细胞经紫外线照射损伤后的细胞应答变化与修复机能减退的关系.
关键词 衰老细胞,DNA 损伤修复, 细胞周期, 检验点控制
DNA 损伤的积累及修复能力的下降是生物衰老的重要原因之一[1]. p53、p21 和ATM 是近年发现的人类细胞3个DNA 损伤应答的检验点控制(check2point control) 基因[2]. p53、p21 不仅作为抑癌基因发挥重要作用, 且在DNA 损伤的细胞应答中起中心调控作用, 它们可调节DNA损伤修复、细胞周期阻断以及细胞凋亡等诸多基因的转录[3]. DNA损伤可诱导基因中的gadd45、gadd153与DNA 损伤后的细胞周期阻滞以及修复也密切相关, 可能作为p53的下游基因而起作用[3]. 这些基因在衰老细胞中有无表达变化及与衰老细胞修复能力的下降是否有关? 至今未见国内外报道. 我们以体外培养的人胚肺二倍体成纤维细胞(2BS)为对象, 研究了紫外线照射后衰老细胞中的DNA 损伤可诱导基因gadd153 以及检验点控制基因p21、p53的表达变化,及其与DNA修复能力和细胞周期变化的相关性.
1 材料与方法
1.1 材料及主要试剂 人胚肺二倍体成纤维细胞引自卫生部生物制品研究所, pB luesSK 质粒(gadd153 cDNA ) 由北京医科大学人民医院惠赠,p21WAF1.CIP1. SDI1cDNA由美国Baylor 医学院惠赠,p53及B2act in cDNA 探针为本室留存. DMEM干粉培养基: GIBCO.BRL公司, 胎牛血清: 北京北郊农场血液制品所, 3H2TdR 及A232P dCTP: 北京亚辉生物工程公司, P rim e2a2Gene Lebeling System:Promege公司, 羟基脲、鲑鱼精DNA、聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白: Sigma公司, 其它试剂均为Sig2ma产品或国产分析纯.
1.2 细胞培养 人胚肺二倍体成纤维细胞(2BS)培养于含10% 胎牛血清的DMEM 培养液中, 37℃温育箱中生长, 传代至62±4 代及24±6 代分别作为衰老及年轻细胞使用.
1.3 细胞形态及增殖特性观察 细胞生长至对数生长期后, 细胞悬液调整至1×104细胞.ml, 移入24孔板中培养, 待细胞贴壁后以紫外线(0145J.m 2.s) 照射5 min 损伤细胞[4],更换新鲜培养液于37℃温育, 每12h观察细胞形态变化并进行细胞计数, 以未进行紫外线照射的衰老及年轻细胞作对照.
1.4 细胞周期分析 紫外线照射剂量、时间同上,37℃温育24h后胰酶消化, 收集细胞, 再用RNA 酶于37℃消化1h, 然后用碘化丙啶(PI)染色, 以Bec2ton2Dickinson 流式细胞仪进行FACScan(fluo res2cence act ivated cell sorting)分析, 以未进行紫外线照射的衰老及年轻细胞作对照。
1.5 UDS (un scheduled DNA syn thes is) 测定 细胞计数后, 以1×105 细胞.孔传于6孔板, 待细胞完全贴壁后,以含015% 胎牛血清的DMEM培养液饥饿细胞72h使细胞同步化,更换含5mmo l.L羟基脲的无血清DMEM 培养液于37℃温育1h后,紫外线照射, 其剂量与时间同上,更换培养液(含5mmo l.L 羟基脲、1LCi.m l3H2TdR、10%胎牛血清的DMEM) , 37℃温育不同时间收集细胞,进行3H2TdR计数, 对照组为未进行紫外线照射的细胞[5]。
1.6 斑点及Northern 印迹杂交细胞处于对数生长期时进行紫外线照射,时间、剂量同上, 然后于37℃温育不同时间收集细胞, 用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA,然后转膜、标记探针及进行斑点和Northern 杂交[6,7] , 以未进行紫外线照射的细胞为对照. 杂交结果由积分光密度扫描分析。
2 结果
2.1 细胞形态及增殖特性的比较 紫外线照射前可见衰老2BS细胞形态与年轻细胞明显不同, 衰老细胞胞体肥大、胞浆内颗粒增多、胞浆混浊、折光性下降、细胞排列极不规则; 而年轻细胞则胞体细长、胞浆清亮、细胞呈漩涡状排列. 紫外线照射后, 衰老细胞形态变化不十分明显, 仅见胞浆内颗粒略显增加; 而年轻细胞则可见胞浆颗粒明显增多、胞浆透明度下降、胞体也略显增大, 但培养约1周后细胞形态基本恢复正常. 紫外线照射前后细胞生长曲线见Fig.1, 经紫外线照射后年轻细胞增殖速率受到明显抑制, 但约6d后增殖能力恢复正常; 衰老细胞增殖速率明显低于年轻细胞, 紫外线照射前后增殖变化不十分明显。
212 细胞周期时相变化 紫外线照射后衰老及年轻的2BS 细胞均可见G1 期阻滞, 而年轻细胞G1 期细胞阻滞率高于较衰老细胞(P<0105) (Fig.2).
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