TTC组织化学染色

为了使经过短暂的MCAO后的局部缺血性损伤更加形象化，大脑被移除，并使用鼠标不锈钢冠状脑模型用四个两毫米厚的花冠状切片剖面，使用有喙的边缘作为一个标志。截面浸泡在2%的TTC溶液中，37 ° C 浸泡15分钟以促进着色。然后从溶液中取出进行数码拍照。缺少TTC着色的梗塞区域使用成像软件Axiovision 4.6测量并使用4个2毫米厚的切片来计算总梗塞面积。

体内时域光学成像

小动物时域光学成像系统Optix MX2((Advanced Research Technologies, Montreal, QC)用于体内成像。Optix MX2既可以探测荧光探针信号强度数据，又可以给出荧光探针所处的位置深度数据。

用体内时域近红外光学成像技术评价BBB的渗透率和/或脑损伤，两个成像模式用于测试经过短暂的MCAO后的小鼠：（1）光学成像采用对比度增强的近红外探针；（2）光学成像测量变化无对比度增强的内源性荧光团。

MCAO前小鼠先使用eXplore Optix成像得到背景图像。动物经过MCAO或重新注入近红外荧光探针Cy5.5（100nmol）（分子量=1kDa；荧光寿命=1.0ns；GE Healthcare，Milwaukee, WI）或者在用Optix进行成像程序前以等体积的生理盐水处理尾静脉15分钟。为确定血脑屏障的不同的分子大小，在一些研究中使用带有Cy5.5标记的牛血清蛋白（BSA-cy5.5,50mg静脉内的）（MW=67kDa）用来增加图像的对比度。同样，对照组也在成像前经过15min的处理，然后注入100nmol的cy5.5或在适宜的时间注入50mg BSAcy5.5。在纵向研究中，在一段时间内进行重复成像，cy5.5（100nmol）总是在成像之前15min注入（时间的比例最高的信号的背景）。在所有的成像实验中,都重复频率为80MHz的670nm脉冲激光二极管和时间分辨12 ps的光脉冲进行激发。当荧光发射在700nm时被高灵敏度的单光子计数器和快速光电倍增管检测。每一个动物都放置在一个倾斜的板上，然后放入加热的（36℃）的成像系统中。动物的最佳的图像都是通过侧面的数字照相机检测。一个二维的扫描区域包括头部都通过顶端的实时数字照相机选择。激光激发通过振镜片进行光束控制，然后移动选择感兴趣的区域（ROI）。每一个像素的激光功率和计算时间在分别在60mW和0.5秒。光栅扫描间隔为1毫米，而且在获得每一个画面时都保持不变。每一个感兴趣的区域扫描300点。数据记录为时间点分布函数，而且图像可以重建如荧光强度（FI），荧光寿命（t）和荧光浓度图（Conc）。

数据分析

每一个动物脑缺血损伤的诱导之前都要通过背景图像采集的基线，之后再后续的成像中去除。前和后注入的图像都被eXplore Optix Optiview 2.1软件自动记录图像(ART Inc, Montreal, QC)，可以排除背景干扰。

每一个成像参数(FI、t、Conc)的测量都是用相同的ROI缺血性左半球和对侧的大脑右半球。经过MCAO后的梗塞区域都依据文献中的描述通过数字地图创建。每只动物的测量区域尽量调整到相同的大小。

FI可以用任意单位代表，反应出光子数，通过激光功率和整合时间，通过以下方式计算光子数÷（激光强度(W)×整合时间（s）。ART公司的3D重建软件用于图像构建，可以从动物轮廓图探测深度和估算Cy5.5浓度。使用小鼠脑组织吸收系数（mua）和减少散色系数（musp）值来确定荧光基团的深度和浓度信息，分别是0.03 mm–1 和 1.5 mm–1。分析的重点集中在荧光基团TPSF最小值和最大值的位置，假设，tTPSF最大值反应的几何图形不依赖于荧光基团的浓度但是滞后如荧光基团的深度增加。因此，荧光基团的深度可以用tTPSF最大值来评价。通过比较实测荧光信号振幅与模拟值，重新得到荧光基团的浓度。

使用OptiView 2.1软件估测荧光的衰减。软件可以通过LM算法测量荧光强度衰减曲线。该算法适用于一个非线性最小二乘最小化算法来计算的多重指数的荧光衰退。