25羟基维生素D酶联免疫检测试剂盒操作要点

检测前将所有试剂平衡至室温，小心混匀。

按照“试剂准备”中所述，复溶或准备相关试剂。

1. 准备已作标记的玻璃试管或聚丙烯管用以标准品、质控品和样本的稀释。

2. 标准品、质控品和样本各取25μl分别加入到相应标记的试管。

3. 所有试管都再加入1ml的25D生物素。用漩涡混合器混合10秒。

4. 各取200μl已稀释的标准品、质控品或样本分别加入已包被抗体的相应酶标板微孔内，做双孔。用封口膜密封酶标板，于18-25℃下孵育2小时。

5. 用稀释好的洗液洗板3次。

a) 自动洗板：设置洗板机分配每孔至少300μl洗液。注满后抽空，如此循环3次。

b) 手动洗板：迅速颠倒倒出孔内物。每孔加入250μl洗液。再重复洗板2次。

在进入下一步之前，于吸水纸上用力拍打倒置的板以除去多余的洗液 。

6. 用多道移液器向所有微孔内加入200μl酶结合物。用封口膜密封酶标板，于18-25℃下孵育30分钟。

7. 重复步骤5。

8. 用多道移液器向所有微孔内加入200μl TMB底物，用封口膜密封酶标板，于18-25℃下孵育30分钟。

9. 用多道移液器向所有微孔内加入100μ终止液。

10. 加入终止液后的30分钟内在酶标仪450nm（参考650nm）波长处测量吸光度。

• 置于室温下至少30分钟，直到平衡至室温。

• 轻轻地反复颠倒混匀。
  
  

• 确保使用前试剂完全复溶。

• 确保所用试管为硼硅酸盐玻璃试管或聚丙烯管，不能使用聚苯乙烯管因为其可引起结果偏低。
  

• 将标准品、质控品和样本直接加入到试管底部，不要粘到侧壁上。

• 使用移液枪时，沿试管壁加入避免溅出。

• 充分混匀10秒。
  

• 加样时确保不接触到酶标板微孔底部。

• 加样时不要距离微孔太高，避免溅出。

• 确保孵育时间刚好。
  
  

• 确保每孔分配合适体积的洗液。

• 避免微孔内产生气泡。

• 洗板后快速轻打酶标板以除去残留洗液。
  
  

• 使用多道移液器时确保每个吸嘴吸取的试剂量相同。

• 使用新的称重盘放置试剂瓶，防止污染。

• 确保每孔内分配的试剂量准确。

• 确保每个孔都已密封。

• 确保孵育时间刚好。

• TMB底物对光敏感且易受污染。仅移取检测所需要的量，丢弃没用完的TMB底物，请勿再倒回瓶内。
  

• 确保酶标仪已设置为正确的波长。.

• 加入终止液后30分钟内读数。