随着超速离心机转速的提高,用超速角式转头分离人血清中白蛋白与球蛋白的离心时间越来越短,用5—20%线性蔗糖梯度作蛋白质速率—区带(Rate—zonal)分离,样品以近等速沉降,低于分析实验结果。下面的简单分离实例有代表性。
设备:
离心机:智能型超速离心机(Hitachi CP—M系列,Beckman L—XP系列)
转头:定角:P90AT,P80AT,比较实验转头:P40ST
P90AT: 90,000rpm, 700,000xg, 8×12ml K=25
P80AT: 80,000rpm, 615,000xg, 8×12ml K=27
P40ST: 40,000rpm, 284,000xg, 6×13ml K=139
离心管:12ml及13ml PA管
样品:标准人血清1 ml (2.5mg/ml),用0.15M NaCl溶解。
梯度液:5—20% 线性蔗糖梯度, P90AT及P80AT梯度液量约9.5ml ,P40ST梯度液量约9.6ml。
方法:5—20%蔗糖梯度液上铺约1ml 人血清,对 P90AT及P80AT必须装满(用血清调节),P40ST加样至距管口3mm。
离心参数:
P90AT:90,000rpm,2小时,2.5小时,3小时,5℃,加速“5”减速“5”
P80AT:80,000rpm,2小时,2.5小时,3小时,5℃,加速“5”减速“5”
P40ST:40,000rpm,14小时,16小时,18小时,5℃,加速“8”减速“8”
曲线绘制:用日立DGF—U 梯度仪通过上口连续取样至带流动池分光光度计连续测O.D.(280nm)后收集。
结果及分析:
转头 | 白蛋白峰顶距离从管口算起的容量(ml) | 球蛋白峰顶距离从管口算起的容量(ml) | ||||
P90AT | 2小时 | 2.5小时 | 3小时 | 2小时 | 2.5小时 | 3小时 |
4.5 | 5.7 | 6.8 | 6.2 | 7.9 | 9 | |
P80AT | 4.3 | 5.5 | 6.6 | 6 | 7.6 | 8.7 |
P40ST | 14小时 | 16小时 | 18小时 | 14小时 | 16小时 | 18小时 |
3.6 | 4.1 | 4.7 | 5.0 | 5.8 | 6.6 |
转头 | 白蛋白峰顶在蔗糖梯度位置% | 球蛋白峰顶在蔗糖梯度位置% | ||||
P90AT | 2小时 | 2.5小时 | 3小时 | 2小时 | 2.5小时 | 3小时 |
10.0 | 11.7 | 13.2 | 12.7 | 14.7 | 16.7 | |
P80AT | 9.9 | 11.6 | 13.0 | 12.5 | 14.5 | 16.5 |
P40ST | 14小时 | 16小时 | 18小时 | 14小时 | 16小时 | 18小时 |
7.5 | 8.3 | 9.0 | 9.9 | 11.0 | 12.0 |
分析:根据以上结果,可以看出:
1.在5—20%蔗糖线性梯度中白蛋白与球蛋白基本上以等速沉降
2.用P40ST或P80AT转头分离人血清白、球蛋白在最高转速离心2.5小时效果最佳,用P40ST转头离心18小时效果最好。
3.用P40ST转头分离的结果O.D. 对离心管从管口算起容量曲线的峰形比P90AT的峰形尖锐一些,但考虑到离心机和转头的寿命,用P80AT 转头离心性价比最佳。