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科学仪器学科与技术进展的研究报告(九)

2020.7.14
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王辉

致力于为分析测试行业奉献终身

  C)Nanopore sequencing (纳米孔测序方法)

  采用完全不同的方法来鉴别DNA分子上的单个碱基,被称为纳米测序。以4种碱基间的物理性质差别为基础,将这种差别转变成为可以检测的信号,从而进行测序。此方法测序的是单个DNA分子,并不需要DNA的扩增。此方法目前还处于理论阶段,仅有实验室的结果。主要面临的挑战是要精炼方法来提高此法检测单个碱基的分辨率。

  D)焦磷酸测序法(Pytosequencing)

  这是个已经被Biotage AB公司商业化和推向市场的很有前景的新技术,是新一代DNA序列分析技术。这个技术是把一个核苷加入4种酶的混合物(DNA 聚合酶,ATP硫酸化酶,荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶)中,利用生物体发光来检测结合到DNA上的核苷。该方法可用于DNA序列分析,配合相应软件可进行SNP分析和SNP频率确定。

  E)芯片上的焦磷酸测序技术

  该方法可以在包含很多小井(well)的芯片上发生。每个小井中包含着一个核苷链的多个拷贝。这项技术就是454测序仪的技术基础。454 life Sciences公司在2005年8月的Nature杂志上公布了他们开发的比传统的Sanger测序方法快100倍的一种技术。美国能源联合基因研究所(JGL)认为,该方法读出的片断较短,且不能提供配对端点测序信息,故将该方法与sanger结合,可获得更有效,更快捷的测序结果。

  F)聚合酶克隆测序(Polony Sequencing)

  这个测序系统的变化之一,就是第一次将聚合酶克隆交联于浸没在乳状液中的珠状微粒上。当扩增反应结束后,每一个微粒上都会携带目的DNA分子的许多拷贝。带有聚合酶克隆的微粒可以分别放在单独的小孔内,或固定在凝胶上,以进行同时测序。

  G)杂交测序

  利用荧光产生的可视信号来进行检测,类似于碱基连接法。这一测序系统由美国生物科技公司——艾菲矩阵公司(Affymetrix)、佩尔金科学公司(Perlegen Sciences)和Illumina公司开发,已经在商业上广为使用。

  除上述各种方法之外,还有其它方法,而且各种方法和系统除了快速读取“字母”(碱基)之外,还需要运算能力足够强大的计算机,迅速处理海量的基因组信息,这仍然是制约快速测序法的一个瓶颈。

  (2)基因转录技术与仪器

  与基因测序技术发展的同时、基因转录有关设备也相继出台。例如:①聚合酶连反应仪PCR:用于基因或重组基因的克隆;②点转仪:它可以比化学方法更有效的把重组的基因转到活体细胞中去表达;③荧光显微镜:主要用来检测转基因细胞的转基因的成功与否;④细胞流式仪:在检测转基因细胞的转基因成功率。此外,还可以把成功的转基因细胞和失败的转基因细胞分开。

 2.蛋白质组学技术与仪器

  (1)以高准确度质谱技术为核心的规模化蛋白质鉴定技术与仪器

  为了适应蛋白质组研究的需要,从高分辨率、高灵敏度的蛋白质分离与鉴定的线性离子阱-质谱仪(LTQ)到2005年刚推出的LTQ-Orbitrap质谱仪,以及具有小于2ppm的准确度的傅里叶变换离子回旋共振质谱仪近几年层出不穷。结合LTQ三级质谱来确证鉴定肽段的可靠性,目前LTQ-FT所产生的数据假阳性率接近于零。LTQ-Orbitrap质谱仪则利用一种全新的理念,用电场模拟达到接近于FT质谱仪的分辨率和小于5ppm的准确度。近期推出的准确质量标签技术(AMT),则利用高分辨率、高重现性的多维液相色谱(UPLC)和高精度的LTQ-FT质谱仪结合,实现蛋白质的准确鉴定。高通量、规模化、高速度和高准确度的蛋白质分离与鉴定技术已经为蛋白质组表达谱的研究提供了崭新的发展平台。

  (2)蛋白组学研究中的机器人工作站

  借用汽车工业自动装配线技术,蛋白质组研究中的机器人工作站的发明和使用,使得高通量、准确、自动化地批量处理样品成为可能。自动化操作系统主要是指实验室自动化工作站,俗称机器人,是由计算机控制的全自动实验室操作设备。试验室自动化工作站的基本功能是可以自动连续地完成试验的基本操作,如加样:即向每个反应单位(微板中的每一个孔)中加入各种不同成分、不同浓度、不同容积的溶液;稀释:实际上就是加入一定容积的样品或试剂溶液后,再加入一定的溶媒;转移:主要是完成某一试剂或样品的位置变化;混合:将加入的不同溶液进行混合,混合的方式有震荡,也可以用加样器反复吹吸混合;洗板:用适当的溶液清洗试验用的微板,或洗除不需要的反应液;温孵:让反应体系在一定的温度条件下保持一定的时间,使之完成反应过程,自动化工作站可以严格控制温孵的温度和时间;检测:试验室自动化工作站一般都可以与某一种或多种检测仪器连接,在试验操作完成后,可以自动进行必要的检测并自动采集、储存数据,完成整个试验过程。

  (3)大规模蛋白质-蛋白质相互作用研究技术与仪器

  大规模蛋白质-蛋白质相互作用的研究是蛋白质组研究的重要内容。其中酵母双杂交技术平台和亲和纯化技术平台易于大规模、高通量和自动化,已经被广泛用于基因功能、蛋白质连锁图和寻找药物靶点的研究。大规模、高通量的酵母双杂交技术平台的核心仪器设备包括自动化的移液操作和酵母菌液涂板技术平台、高通量的菌落计数和挑取机器工作站、自动化的PCR反应和测序工作站。一套技术平台平均每天可以完成10~20个蛋白质相互作用的筛选和鉴定工作。自动化移液操作和酵母菌液涂板技术平台平均每天可以处理150mm的平板500- 1,000个。高通量的菌落计数和挑取机器工作站每天可以挑取菌落5,000个。自动化的PCR反应和测序工作站可以每天测序反应5,000个。大规模、高通量的亲和纯化技术平台的核心仪器设备包括大规模的生物反应器、旋转培养箱、高通量的蛋白质纯化技术平台、多维色谱分离与MALDI-MS /ESI-MS技术平台。整套技术平台每天可以鉴定10~20个蛋白质复合体。

  (4)蛋白质组生物信息学支撑技术

  蛋白质组研究的另一大特征是研究对象的众多与产生数据的“海量”。在已经成功的人类基因组计划中,也产生了海量数据。蛋白质作为基因的最基础单位,采用“大科学”模式来诠释和转化这些数据具有很重要的意义。生物体内涉及的蛋白质种类数以百万计,且含量大小横跨10多个数量级。因此,为了保证其研究结论的准确性、重复性,必须建立符合科学条件的生物信息支撑体系。

  生物信息学通过超级计算机、蛋白质信息学软件、工具、数据库及平台对蛋白质科学与技术研究实现全流程数据管理、分析、发布、交换、支持,实现不同层面、目的、来源的实验或分析数据的网络型知识库;实现为以数据为驱动的理论蛋白质科学研究信息平台和国家级蛋白质科学研究网络(虚拟国家实验室),已经使生物信息学成为实现成员实验室数据资源、分析资源与计算资源的系统整合和无缝共享的重要技术支撑。


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