PCR（聚合酶链式反应）
【原理】
PCR（polymerase chain reaction）用于在体外将微量的目标DNA大量扩增，以便进行分析。反应体系：①样品DNA；②引物（primer），是人工合成的一对寡核苷酸链（约15-20个核苷酸），用于扩增夹在双引物与模板DNA互补区之间的区域；③4种dNTP；④Tag DNA聚合酶，是从一种嗜热水生菌（Thermus aquaticus）中分离出来的。此酶最适作用温度为75～80℃，但短时间在95℃下不失活。⑤适宜的缓冲体系和适量的Mg2+。反应过程：①变性：将反应液置于PCR仪中，提高温度（约90-95℃）使DNA双链解离；②复性：降温（约60℃左右）退火，使引物与模板结合；③延伸：升温度至70-75℃，在引物的引导下合成模板单链的互补链，从而形成DNA双链片段；④重复上述“变性——复性——延伸”的过程。最初几次循环中形成的长链DNA较多，但随着反应的进行，长链DNA以算术级数增加，而夹在两个引物之间的目标DNA以指数级数增长，经大约20—30次循环后，扩增产物中主要是目标DNA。
【材料】
1. 试剂和溶液
（1）10 × PCR缓冲液
500 mM 氯化钾
100 mM Tris-Cl (室温时pH 8.3)
15 mM 氯化镁
（2）10 mM脱氧三磷酸核苷(dNTPs) 溶液－含有所有四种dNTPs(pH 8.0)
（3）耐热的DNA 聚合酶：
① Taq DNA 聚合酶是从表达克隆嗜热水生菌的DNA 聚合酶基因的大肠杆菌提纯而来。此酶有5’→3’ DNA聚合酶和5’→3’外切酶活性，但是缺乏3’→5’ 外切酶活性。此酶由分子量约为94 千道尔顿的多肽组成。Taq DNA聚合酶对热稳定，能在较高的温度下利用引物将单链模板合成为DNA。 催化一典型的PCR所需酶量约为2单位。加酶量过多则有可能导致非靶序列的扩增。
Taq DNA 聚合酶缺乏校正功能，在PCR过程中核苷酸掺入错误率可达每循环2 × 10-4个核苷酸，约比使用大肠杆菌DNA聚合酶 I 的Klenow片段时高4倍。对于一个30轮循环的扩增反应来说，这一掺入错误率将导致0.25％的总错误频率。这一频率似随和浓度的升高而增大。这些错误的掺入可以发生在扩增产物的任何位置，既有颠换也有转换（但并无长的缺失、嵌合或插入）。
单位的定义：一单位是指于74ºC将l0 nmol的脱氧核糖核苷酸30分钟内掺入到酸性沉淀的物质中。其实验条件是：25 mM TAPS (pH9.3), 50 mM 氯化钾, 2 mM 氯化镁, 1 mM DTT, 0.5 mg/ml 有活性的鲑鱼精液DNA, 0.2 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP。
② rTth DNA聚合酶是Thermus thermophilus(Tth)和Thermococcus litoralis(Tli)两种菌中耐热DNA聚合酶的混合。这种混合酶特别具有5’→3’DNA 聚合酶和3’→5’外切酶（校正）的双重活性。当按推荐量使用时，此酶可提高保真度及长链PCR的产量。
常规PCR扩增靶DNA序列一般在5 kb以内。而rTth DNA 聚合酶可从人类基因组DNA中扩增至19.6 kb的β－球蛋白基因群和噬菌体λDNA的42 kb的片段。
（4）琼脂糖凝胶
（5）10 µM的上游和下游引物
（6）DNA模板
（7）对照DNA（含有靶序列的DNA）
（8）DNA长度标准参照物
2. 设备
（1）0.2 ml PCR扩增管
（2）可预先设定扩增方案的温度循环器(PCR仪)
首页
