【方法】
方法一、基本的PCR方法
下面介绍的基本PCR方法可作为任何PCR扩增的一般指导和出发点。由于各种PCR反应条件（如PCR扩增次数、温度、Taq DNA聚合酶的浓度、引物、氯化镁以及模板DNA）变异极大，应根据具体情况，对各种PCR反应条件进行相应调整。
1．按以下次序，将各成分加入0.2 ml灭菌扩增管中：
成分 体积 终浓度
10 × PCR缓冲液 5 µl 1 ×
10 mM dNTP溶液(pH 8.0) 1 µl 每种0.2 mM
10 µM 上游引物 2.5 µl 0.5 µM
10 µM 下游引物 2.5 µl 0.5 µM
5单位/µl 耐热DNA聚合酶 0.5 µl 2.5单位
DNA模板 1-10 µl 1 pg-1µg
消毒的蒸馏水 至50 µl
* 我们主张，对于多管反应可配制混合液于一管中，然后分装至各管，以减少试剂损失和各管分别加样的不准确性。
2．将小管中的混合物混匀，并加入50 µl矿物油或硅化油覆盖小管中的混合物。
3．盖紧小管，短暂离心，以使PCR混合物沉于管底。
4．小管在温度循环器（PCR仪）中94ºC温育3分钟，以使模板DNA完全变性。
5. 按以下方法进行25-35个循环的PCR扩增：
变性 94ºC 30秒
退火 55ºC 30秒
延伸 72ºC 1分钟/1 kb
6．72ºC温育PCR样本10分钟，可于4ºC维持。样本可贮存于-20ºC直至使用。
7．采用琼脂糖凝胶电泳分析PCR反应产物，溴化乙锭染色显影DNA，用合适分子量标准的DNA作参照。
方法二、热启动方法
热启动PCR的方法是在反应温度降至80ºC时添加Taq DNA聚合酶，以保证高特异性PCR产物的合成。
1．如基本的PCR方法所述，添加所有的PCR反应的混合物，但不加Taq DNA 聚合酶。
2．将小管中的混合物混匀，并加入50 µl矿物油或硅化油覆盖之。
3．盖紧小管，短暂离心，以便于PCR混合物沉于管底。
4．小管在PCR仪中94ºC温育3分钟，以使模板DNA完全变性。
5. 94ºC温育后，维持PCR反应在80ºC。
6．每一PCR反应管添加0.5 µl (2.5 U)的 Taq DNA 聚合酶，注意应保证酶加入到油下面的PCR混合物中。
7．按照基本的PCR方法所述，继续完成25-35个循环的变性、退火和延伸。
首页
