4．我们上面介绍的只是一种基本的PCR反应条件，对于具体的每一种PCR反应，反应条件差异很大，需要根据情况调整。
（1）时间：上面介绍的时间适用于在0.2 ml薄壁管进行PCR反应，其反应体积为50 µl，热循环仪为Perkin-Elmer 9600 或9700、Master Cycler PCR仪（Eppendorf公司）和PTC 100（MJ Research公司）。如PCR的设备和反应体积发生改变，则时间和温度均需要调整。
每一步的时间应从反应混合物达到所需要的温度后开始计算。一般来说，由混合液原温度达到所要求温度的时间需要30-60秒。温度滞后时间的长短取决于以下几个因素，包括反应管的类型、反应混合物的体积、热源（水浴或加热块）以及两个连续步骤间的温度差。因此调节温育时间以补偿这一滞后时间是非常重要的。
两寡核苷酸引物之间的距离越远，合成靶序列全长所需的时间也越长。上面给出的反应时间是按1000个核苷酸的靶序列拟定的。
（2）温度：选择寡核苷酸引物到DNA模板的退火温度是一个折衷的方案。如果降低退火温度则扩增效率提高，但引物与模板间的错配现象又可明显增加。若将温度提高，则扩增反应的特异性增加，但总的反应效率则会下降。因此理想的办法是设置一系列对照反应，以确定某一特定扩增反应的最适退火温度。
（3）循环次数：扩增反应的循环数取决于反应混合液中靶DNA的浓度，若将哺乳动物基因组中单拷贝基因扩增至能为琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳所见，至少需要25个循环。
靶序列的指数式的扩增不是一个无限制的过程。在正常反应条件下，经过25-30个循环扩增（即扩增约106倍）后，Taq DNA聚合酶的酶量便成为制约反应进行的因素。如需进一步扩增，应将所得的DNA样品稀释1000至10000倍后，再作为模板进行新的PCR。
（4）缓冲液：当标准缓冲液于72ºC温育时，反应体系的pH值将下降1个多单位，致使缓冲液的pH值接近7.2。二价阳离子的存在至关紧要，镁离子优于锰离子，而钙离子则无效。镁离子的最佳作用浓度相当低(1.5 mM)，因此重要的是，所制备的模板DNA中不应含有高浓度的螯合剂，如EDTA；也不应含有高浓度的带负电荷离子基团，如磷酸根。所以，用作模板的DNA应溶于10 mM Tris-Cl (pH 7.6), 0.1 mM EDTA (pH 8.0)中。
在较为广泛的范围内，这种标准缓冲液对于各种模板的寡核苷酸引物都能行之有效，当它并非对于模板与引物的任何一种特定组合都是最佳的。因此，应当将以上所列条件作为出发点进行修饰和改良。每当首次使用靶序列和引物的一种新组合时，或者，dNTPs或引物的浓度变化时，特别要将Mg2+浓度调至最佳。dNTPs是反应中磷酸根的主要来源，其浓度的任何变化都将影响到Mg2+的有效浓度。我们建议设置一组反应，其中每一反应的Tris-Cl (10 mM)和氯化钾 (50 mM)浓度相同，而氯化镁浓度不同（0.05-5 mM，每次增加0.5 mM）。反应结束后，通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色来比较各扩增产物的量。
PCR可在热循环仪（即PCR仪）中自动进行，以使反应各循环标准化。
5. 一般来说，如第一次用新的模板DNA、新的引物或者新制备的耐热DNA聚合酶作PCR，扩增将不如预期理想。PCR反应条件需仔细调整，以抑制非特异扩增和（或）提高目标DNA的产量。
6. 一个成功的PCR扩增反应，可出现一个显而易见的与预期大小一样长度的DNA片段，此可通过DNA序列分析、Southern 杂交和或限制性图谱分析确定。
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