5、反应体系配制:
ð A2010A0101试剂盒:(探针体系)
FQ-PCR MasterMix-UNG混合物(2X) 25ul(终浓度为1×);
上游引物(终浓度为50~900nM),下游引物(终浓度为50~900nM);
探针(终浓度为200nM);
待检样品 5ul(终浓度为10~100ng);
无菌去离子水 补足,使总体积达到 50ul 。
ð A2010A0106 试剂盒:
反应体系终浓度:
1-2U的hot start Taq酶、2.5-4.0mM的Mg2+、0.2-0.4mM的dNTPs、1×PCR buffer(A2010A0106);50-900nM 的上游引物、50-900nM 的下游引物、200nM的探针、通常取2-5ul的模板,反应总体积通常为20-50ul
ð 自配热启动荧光-UNG 体系:
1-2U的Taq酶、1×PCR buffer、2.5-4.0mM的Mg2+(A2010A0104);0.2-1U的UNG酶(A2010A0107)、0.2-0.4mM的d(A,C,G)TPs、0.3-0.6mMdUTP(A2010A0108);50-900nM 的上游引物、50-900nM 的下游引物、200nM的探针、通常取2-5ul的模板、反应总体积通常为20-50ul
6、反应体系和条件的优化;
使用高产量,特异和灵活的定量PCR试剂体系FQ PCR MASTER Mix-UDG(hot start),最大程度降低了需要优化的参数。您只需要优化退火温度,就可以得到更灵敏、更可靠的定量结果。对于特殊结构的荧光PCR,您可以优化引物浓度,来得到更特异或更灵敏的结果。
使用通用PCR Master Mix 试剂盒进行反应体系的配制,可以适合更多的反应体系,如mRNA的普通RT-PCR检测,适用于合成质粒的PCR,同时也适用于荧光PCR,范围更宽。
采用成套的hot start Taq酶,您需要对酶量、镁离子浓度、UNG浓度、dUTP浓度、引物浓度、退火温度等参数进行优化(参照3:影响PCR及荧光PCR 的其他因素)进行优化,优化的指标越多,实验的不确定性就越大。避免在操作中引入更大的不确定性和不可重复性。注意:同样可参照的QPCR MASTER Mix-UDG(hot start)使用注意事项。
7、适用的荧光仪器、实验设计、荧光曲线和数据分析;
目前市场上有许多种实时PCR仪:其中包括ABI7700,ABI7900,ABI7000 (Applied Biosystems);MX4000 (Stratagene);iCycler (Bio-Rad);Smartcycler(Cepheid);Robocycler (MJ Research);Lightcycler (Roche);ROTORGENE(CORBERT) ;杭州博日(Linegene)。
不同的仪器使用方法有所区别,但都具备对Taqman 探针和sybgreen 染料法的检测波长和检测能力。QPCR MASTER Mix-UDG(hot start)和通用PCR Master Mix均适合在这些仪器上进行使用。
为确保实验数据的有效性,每次实验都设阴性对照和4个标准品,每个样品都平行做2个复孔。
基线或阀值的设定 通常是以10-15个循环的荧光值作为阀值,也可以以阴性对照荧光值的最高点作为基线。
8、疑难解答
问 题 | 可能原因 | 建议解决方法 |
定量PCR 无扩增产量或很少的扩增产量 | DNA模板质量不好,含有抑制剂 | 提高模板质量,诸如DMSO,SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂,可以使用乙醇沉淀DNA |
PCR引物设计较差 | 避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。 | |
探针设计较差 | 对探针序列进行blast比对,设计符合要求的探针 | |
PCR引物合成较差 | 用普通电泳法,看引物的设计和合成质量,是否有目的条带出现。 | |
荧光探针无功能 | 确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。 | |
模板浓度太低 | 使用10^4拷贝的靶序列,以在25到30个循环中获得信号。 | |
镁离子浓度太低 | 从3mM到5mM,间隔0.5mM进行一系列反应,确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。FQ-PCR MasterMix-UNG 试剂盒不需优化镁离子浓度。 | |
引物浓度太低 | 最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度,在260nm测量光密度,然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。(见公式1) | |
选择优质酶进行扩增 | 选择hot start Taq酶进行扩增,可提高灵敏度,增加产量,降低干扰因素 | |
退火温度太高 | 使用表4的公式估算Tm,把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值,所有真正的退火温度实际会高些或低些。 | |
反应物中有不明物干扰 | 在各个反应物中存在不明物质对PCR进行干扰,对任何实验样品或试剂,均应采用无菌无酶无热源的离心管进行试剂的分装和使用。 | |
定量PCR阳性对照无扩增曲线(针对:已经优化好的体系) | 引物、探针设计合格;原来合成质量已经验证。需确认: | 反应成分是否漏加;确定反应条件是否合适; 正常标本是否能扩增来判断是对照的问题还是体系的问题; 确认体系:1、引物是否降解(看扩增产物是否可电泳出)来判断引物和酶功能;2、探针是否降解(用DNase处理TaqMan探针,校验荧光是否增强)。 |
仪器是否正常工作 | ||
定量PCR阴性对照一直有扩增曲线 | 模板或PCR残余污染 | 隔离污染来源,更换试剂。 使用UNG/dUTP防污染系统。 在无DNA区域准备反应,使用抗气溶胶的吸头。 |
体系有问题 | 酶浓度不对,Mg离子浓度不对 | |
定量PCR(染料法)出现非特异信号 | 引物二聚体多 | 检查引物设计和合成环节,必要时更改引物 |
更换热启动酶 | 热启动酶能增加反应的特异性,提高灵敏度 | |
设定检测信号时的温度 | 在更高的温度下检测荧光信号(此时引物二聚体已经解链) | |
定量RT-PCR | 无cDNA合成 | |
cDNA合成温度太高 | 降低保温温度 | |
反转录cDNA产物被二级结构封闭 | 提高保温温度。重新设计引物 | |
RNA被损害或降解 | 必要的话更换RNA | |
RNAse污染 | 维持无菌条件;加入RNase抑制剂 | |
荧光探针无功能 | 确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。 | |
灵敏度低 | 初始模板RNA不充分 | 增加模板RNA的浓度;使用10ng-1µg的总RNA |
RNA被损害和降解 | 必要的话更换RNA | |
RNAse污染 | 维持无菌条件;加入RNase抑制剂 | |
无效的cDNA | 通过增加70%乙醇清洗的次数来去除制备RNA过程中的抑制剂 | |
无效的PCR扩增 | 注意:反转录的抑制剂包括SDS、EDTA、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚精胺。 | |
检测使用仪器 | 扩增仪温度检查和荧光仪器温度和信号检查,是整体滞后还是个别孔滞后 | |
PCR忠实性:PCR在产物序列中引入了错误 | 采用荧光探针法 | 增加结果特异性和产物的忠实性 |
循环数太多 | 降低循环数。 | |
四种dNTP的浓度不同 | 制备新的dNTP混合物,保证四种核苷浓度相同。使用预混合物。 |