反应条件对杂交的影响

(一)杂交的反应条件

    自1975年Southern发明Southern杂交方法以来，人们又发展了许多方法可以使溶液中的放射性探针与固定在滤膜上的核酸杂交，这些方法在原理上都基本相同，所不同之处只是反应条件。反应条件有如下主要区别。

    1．所用的杂交溶剂和温度不同，如水溶液中68℃，50％甲酰胺溶液中42℃。

    2．溶剂的体积和杂交时间的长短不同对较大的体积杂交时间可长达3d，而较小的体积杂交时间则短至4h。

    3．杂交过程中搅动的方法和程度不同可分连续振荡或静止。

    4．用不同的试剂(如Denhardt^,s试剂或一种由5％脱脂奶粉组成的Blotto)作为封闭剂，以阻止探针非特异性地附着在固相载体表面。

    5．标记探针的浓度及其比活性不同。

    6．是否用其他化合物，如硫酸葡聚糖或PEG，以提高核酸重新结合的能力。

    7．杂交的清洗是否严格。

    (二)影响杂交的因素

    以上这些条件的改变，对杂交有不同的影响，应根据实验的具体情况，选用适当的方法。现将各种因素对杂交的影响介绍如下。

    1．在50％甲酰胺、42℃条件下的杂交反应与在水溶液中、68℃下进行的反应相比，前者对硝酸纤维素滤膜更温和，但它的杂交速度比水溶液中约慢2—3倍。通常两种溶液都能获得良好的结果，彼此也无明显的优劣之分。

    2．杂交溶剂的体积越小越好，在小体积溶液中,核酸重新配对的速度更快，探针的用量也少，从而使滤膜的DNA在反应中起主要作用。但在杂交中必须保证有足够的溶液使滤膜始终被覆盖。

    3．连续振荡探针溶液是为了在用数张滤膜进行杂交时防止相互粘连，一般情况下不需要连续振荡。

    4．许多试剂可阻止探针与滤膜表面的非特异性吸附，它们包括Denhardt，s试剂、肝素和脱脂奶粉。这些试剂一般与变性断裂的鲑鱼精子DNA或酵母DNA和SDS一起配合作用。对低度mRNA的Nothorn杂交或哺乳动物DNA单拷贝序列的Southern杂交，一般用5XDenhardt，s试剂、0．5％SDS和100／1g／m1变性断裂的DNA组成的封闭剂预杂交滤膜。但在大多数情况下，可使用0．5％脱脂奶粉。与Denhardt’s试剂相比，脱脂奶粉更便宜，使用也方便，并可获得同样满意的结果。但它不能用于RNA杂交，因为脱脂奶粉中含有较高的RNA酶活性。一般而言，对尼龙膜用Denhardt’s试剂比用脱脂奶粉能得到更高的信噪比。

    5．杂交时间  对双链探针掌握下述粗略的估计方法并控制杂交反应时间，可保证溶液中的探针达到1～3Cot_1/2。

    在10ml杂交液中，如g 5kb长的探针在2h内可达到Cot_1/2，对其他任何探针可用下列方程式：

(1/x)×(y/5)×(z／10)×2＝达到Cob_1/2的小时数

    式中：x=所加探针量(ug)，y＝探针的长度(kb)，z=反应体积(m1)。

    杂交达到3XCot_1/2后，对能继续进行杂交的探针即可忽略不计。对于单链探针，杂交时间还可缩短，因为在溶液中无竞争反应，有利于探针与固定在滤膜上的DNA杂交。

    6．对硝酸纤维素滤膜，通常在预杂交溶液和杂交溶液中都含有封闭剂。但是对尼龙膜，经常从杂交溶液中省去封闭剂，因为高浓度的蛋白质会干扰探针和目的基因退火。当使用的探针或寡核苷酸长度低于100个核苷酸时，杂交信号的掩盖作用特别明显。

    7．加入10％硫酸葡聚糖或10％PEG，杂交速度可增加约10倍。这对检测稀有序列很有用，但对筛选细菌或噬菌斑却无效。此外，它们有时会导致本底较高，并由于它们的黏稠性而使杂交溶液难以操作。因此，除杂交速度非常慢，滤膜上含有的DNA量很少，或放射性探针的量有限之外，不要用硫酸葡聚糖或PEG。

    8．在水溶液中杂交时，用6×SSC或6×SSPE溶液的效果都一样，但在甲酰胺溶液，中杂交时，应该用6×SSPE，因为它具有更强的缓冲能力。

    9。一般而言，洗涤条件应尽可能严格，通常在低于杂交体解链温度(melting ternperature，Tm)即12—20℃的条件下进行。

    10．为了降低本底，应尽量少用探针，并在最短时间内完成杂交反应。