ELISA试验以灵敏度较高、特异性较好的特点在临床上得到了广泛的应用,但操作中各个环节对试验的检测效果影响较大,如不注意,有可能导致显色不全、花板等结果。在此,我们将操作中各个环节常出现问题的原因及解决办法总结如下:
操作 | 注意问题 | 解决方案 |
加样 | 1、血清或血浆标本分离不好即进行加样
2、手工操作中,加样板过多造成加样后放入孵育箱前等待时间过长(特别是室内温度较高时)
3、加完标本再加酶试剂时酶溅出孔外 | 1、标本为血清,最好将血液先自然存放1-2h后,再用3000rmp离心15分钟,标本为血浆:必须使用含抗凝剂的血液标本收集管,采血后必须立即颠倒采血管混合5-10次,放置一段时间后,3000rpm离心15分钟;若在几天内检测,可放在2-8℃冰箱中,若要储存,则置于-20℃的低温冰箱中 2、加样后及时放入孵箱 3、加酶试剂后用吸水纸在酶标版表面轻拭吸干 4、如果采用AT或其他全自动加样,最好选择FAME或其他后处理仪器加酶试剂 5、酶标本较多,请分批操作 |
孵育 | 1、孵育时未贴封片或加盖,使标本或稀释液蒸发,吸附于孔壁,难于彻底清洗 2、孵育时间人为延长,导致非特异性结合紧附于反应孔周围,难以清洗彻底 | 1、贴封片或加盖 2、按说明步骤严格控制操作时间 |
洗板 | 1、采用手工洗板,孔与孔之见液体交叉 2、采用半自动洗板机洗板时,洗液量不足,导致洗板不彻底;洗板针堵塞,抽吸不完全;洗板不畅,导致洗板效果差 3、反应板过多造成洗板等待时间长 | 1、保证洗液注满各孔,洗板针畅通,洗完板后最好在吸水纸(选择干净、无或少尘的吸水材料)上轻轻拍干
2、合理安排,或多用几台洗板机 |
显色 | 1、显色剂配制后放置时间过长或使用过期显色剂 2、加显色剂时溅出孔外造成液体回流 | 1、显色剂尽量在临用前配制,坚持不用过期显色剂,肉眼可见浅蓝色的TMB显色剂不用 2、加样时保持显色剂不外流 3、A、B液应避免接触金属器械 |
终止 | 加终止液时产生较多气泡,导致假阳性增加 | 加终止液时应避免产生气泡 |
读板 | 读板时板底不清洁 | 应保持酶标板清洁 |
全过程 | 1、整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸 2、实现ELISA检测标准自动化,有效提高检测质量 |
实际操作中,除了选择优良试剂外,必须严格按照操作步骤进行操作,同时做好室内质控、室间质评,以严谨的工作作风检测每一份标本,才能保证检测治理。现在国内已有相当数量的单位拥有全自动酶标仪,这对于实现ELISA标准化检测、提高检测质量起到了重要作用。