使用非损伤微测技术（NMT）研究盐胁迫的新机制（一）

前言

在盐生环境中，Na⁺的毒性是降低植物生长能力的一个主要原因。在农业生产中经常使用几种方法来减少Na⁺的毒性，使用复合物，例如石灰、石膏。在不同的植物中广泛报道了增加Ca²⁺可以改善Na⁺的毒性。然而，在细胞水平Ca²⁺的调节机制并未完全得知。Ca²⁺和大量的胞内和胞外标记物发生相互作用而减少Na⁺的毒性。目前，SOS胁迫信号途径是盐胁迫下植物离子动态平衡的关键调节者。盐胁迫激活了SOS3-SOS2蛋白激酶途径从而引起了胞质Ca²⁺浓度的升高。这导致质膜Na⁺外流转运体SOS1和通过质膜高亲和转运体HKT1的Na⁺内流，因此帮助细胞保持K⁺/Na⁺的动态平衡。胞液中Ca²⁺浓度上升的范围依赖于胞外的Ca²⁺浓度，直接支持这个模型的实验证据一直很缺乏。

增加胞外Ca²⁺浓度能够通过CaM依赖的蛋白激酶刺激质膜H⁺-ATPase的活性。在盐胁迫条件下，增加质膜H⁺-ATPase活性对于膜电压的重新极化是必需的，从而保持膜的完整性和离子的动态平衡。通过SOS1 Na⁺-H⁺反向转运体控制的Na⁺外流最终依赖于H⁺-ATPase的活性。拟南芥根内胚层质膜H⁺-ATPase活性的丧失导致对盐的敏感性。SOS3-SOS2途径的Ca²⁺刺激过Na⁺-H⁺反向转运体促进液泡Na⁺的丢失。因此，Ca²⁺作为一个胞内调控者在盐忍耐中起到重要作用。

Ca²⁺提供快速的保护作用，而细胞壁、膜脂和蛋白质提供长期的保护作用来抵御盐胁迫。胞外Ca²⁺通过Na⁺内流抑制质膜渗透性非选择阳离子通道（NSCCs）。使用多种电生理技术进行研究，例如：非损伤离子流测定技术、多种平行离子选择电极技术、膜片钳技术、膜电位测定。在根和叶片细胞中，胞外的Ca²⁺能够通过质膜外表K⁺渗透通道直接抑制减少或者完全阻止Na⁺诱导的K⁺流失， 这是Ca²⁺通过K⁺通道改善Na⁺诱导的毒性的另一种关键过程。

本文重点介绍：如何准备适用于非损伤微测技术测定的植物组织样品，如何进行测定，以及得到的结果。

材料和方法

1 植物材料

拟南芥：野生型（Columbia），akt1突变体

2 利用非损伤微测技术测定净K⁺和Na⁺的流动

使用离子选择振动微电极进行非损伤测量K⁺和Na⁺的净流量。电极在使用前用一套标准溶液进行校正，0.1-1mM的K⁺，0.2-50mM的Na⁺。离子选择电极放置于可控制三维运动的操纵器上，电极尖端距离组织表面20μm。测量时，计算机控制电极在距离组织表面20μm和50μm的两点间移动，频率为0.2Hz。记录的电势差使用校正电极的Nernst斜率转换成电化学电势差，离子的流动通过MAGEFLUX进行计算。

叶片表皮组织用镊子从叶表皮分离得到，切取小块组织（3-×4mm），尽可能地避免对组织的伤害，准备好几小时后开始离子流的测定，使用NMT(或称MINF)测定拟南芥的根尖（切取大约8mm的根尖部分）。根或者叶片水平固定在4mL 的测量容器中，测试液是碱性溶液，包括0.2mM KCl，2mM MES，4mM Tris （pH 5.8），以及少量的CaCl₂，放在三维操作系统上。稳定状态的离子流测定5-10分钟。然后测定的结果转换成离子流动力学。