在受激发射损耗(STED)显微镜的开发过程中，持续性的进展虽然表现得很慢，但确信可以满足具有超高分辨率的荧光显微镜在方法学上的需求，而且也许会给其它的成像模式带来一些意想不到的好处。

早在1994年，Stefan Hell首先提出了受激发射损耗(STED) 显微镜的概念，两年后，这种显微镜就展现在人们面前。自从那时以来，他领导的研究小组就对这一技术进行了持续的改进，结果这一技术在近期一些奇妙的生物学发现中发挥了重要作用。抛开这一进展不谈，这一实验方法并没有被外界广泛使用，其原因是由于在建设STED显微镜时需要可调式脉冲激光，而且我们还会想起双光子显微镜当时所要面对的情形：在早期阶段，人们并不是十分清楚它带来的益处是否会超过它的花费。

Hell及其同事近来有两篇论文出版，一是发表在《美国科学院院刊》，一是发表在本期的《自然-方法学》上。这两篇论文介绍了在STED显微镜技术的开发和应用过程中所取得的持续进展。发表在《自然-方法学》上的报告，首次阐释了STED显微镜能够用于荧光蛋白质，这是利用STED显微镜实现活细胞成像过程中的重要一步。

发表在《美国科学院院刊》上那篇报告所介绍的进展，具有更为重要的潜在意义。Donnert等人报告了一个惊奇发现--将STED所使用到的配对照明脉冲之间的间隙宽度进行扩展时，导致了更低的光致褪色效应和更高的荧光发射现象。

光致褪色效应总能在STED显微镜中观察到，因为这一技术使用了一种很高的发光强度，大约是典型的单光子荧光显微镜的10-100倍，虽然染色剂并不希望能吸收这一波长。即使这一强度不到多光子成像激发强度的百分之一，甚至千分之一，STED显微镜使用了与单光子成像技术中一样的可见光谱区和脉冲中相似数量的光子。

漂白的发生通常源于荧光团转移到一种被称为“三线态”的受激能量状态。这是一种长期活跃的状态，能在更宽的波长范围内吸收光子，非常有利于漂白发生。“很显然，在三线态和高强STED脉冲之间一定有着某种联系，” Hell说。“我们确信，我们能通过这样的一种方式改变设置，使得重复率变得更低。”脉冲之间存在的更长时间，应当为三线态中的任何分子提供时间，以便转换回基准态。他们称这种照明方法为三线放松型(T-Rex)STED。

不仅仅减少重复率导致了漂白效率的降低，而且它还导致荧光信号强度产生了实质性的增加。Hell说，“信号增强得如此之大，以致于录音时间的有效加长仅仅通过4-10这一因子增加，”不管在实际的照明时间中有30-80倍的减少。这一简单的变化使得它们能够应用一种十倍光强的STED光束。根据管理STED显微镜分辨率的平方根法则，这一十倍光强导致了另一三倍分辨率的增加，降低到20nm，也就是低于衍射栅栏的某一尺度。

虽然降低重复率导致了发射强度的极大增强，Hell及时补充说，“这不是我愿意推荐的最终解决方案。真正的方案是快速扫描。如果你扫描得很快，致使仅仅一两个脉冲撞击相同的分子，接着光束会消失，那么你就取得了相同的效果，但你保持住了来自样品的荧光流。”不幸的是，在STED显微镜中要实施快速的扫描在技术上还不太可能。

STED显微镜能否成为一种重要的成像模式，以便能为荧光成像提供超高的分辨率？上述进展为此提供了美好的前景。下一个大的进展很可能就是光束扫描。这不仅仅能进行活细胞成像，而且还能提供一个实施T-Rex STED的理想方式。

有意思的是，为何T-Rex的益处不应当推广到那些像双光子显微镜使用脉冲激光的任何成像模式呢？这并没有任何理论上的原因。也许可以发现，脉冲激光应用于T-Rex以获得传统的单光子成像可能也有一些优点。在改进STED显微镜技术的过程中，如果最终的革新之一是以对荧光显微镜产生普遍性的显著影响为结果，那将是很滑稽的。