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如何选择BTX转基因仪(电转仪)?(一)

2020.7.27
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王辉

致力于为分析测试行业奉献终身

1、确定目标对象:也就是你所有转的目的物是什么东西?
    细胞系和细胞类型
    细胞类型包括人类、哺乳动物、细菌、植物、藻类、霉菌、寄生虫等
    细胞系包括CHO, COS, Jurkat, Saccharomyces Tobacco, Corn,  Rice, Tomato,Trypanosome,E coli等

2、其次确定目的
  目的包括:转染  转化   电整合  电插入  活体/卵的应用  核移植和克隆  细胞融合
     
  然后根据这些来确定该选择什么类型的仪器。
1、  某位老师使用化学法转化大肠杆菌E.coli。他希望构建cDNA文库,但是不能得到好的转化效率。他以后还想做哺乳动物细胞。如何来选择仪器:
    选择方案:ECM 399将是较好的选择,这仪器用来转化E.coli效果十分理想,同时操作简单。如果有足够的预算,可以选择ECM 630, 这样更符合他现在和将来的需求。
     
2、某位老师想要进行一些鸡胚的研究工作,他们希望转染鸡的眼睛,以便研究视觉膜的发育过程。他对卵的基因传递有一些了解。
     选择方案:完成这个转染过程需要 ECM 830和活体电极Genetrodes。由于目标区域很小,他需要小的长的genetrode。方波适合动物体的活体转基因,同时针形的电极是卵的转基因的首选。

3、遗传研究中心希望开展某种疾病的基因治疗,首先从小动物例如小鼠,以后要在狗、猪等动物体开展。客户最初希望用基因枪的方法。但是觉得条件不易控制。
     选择方案:基因枪不是理想的活体转基因的方法。基因枪容易伤害哺乳动物的组织,同时条件可控性差,DNA的转移效果不理想。推荐使用ECM 830 和2 Needle Array 用于小动物研究,对于大的动物研究的话还需配 caliper electrode。
     
4、Dr. Mendle使用agrobacteria来转化烟草的原生质体。他在寻找快速在完整的植株上完成转基因的方法。此时如何选择?
     选择方案:ECM 630和特殊电极。电极的选择需要根据植物转基因的部位。一般有三种电极可以选择Tweezertrode、 Caliper Electrode、 Needle Arrays.根据他所转的植物体大小,硬度等进行
     
5、Dr. Hofmann正使用脂质体方法转染原代神经细胞,但是结果差强人意,仅得到1%的转染效率。但是他不希望使用电转,因为怕杀死细胞。这些希望不能被胰蛋白酶消化(会引起其他变化)所以他不能使用样品杯。给怎么办。      
     选择方案:推荐使用ECM 830 和petri dish 电极或者epizap电极。这样可以用最温和的方法完成原位转基因。
     
6、 Dr. Bloom希望你给他推荐一款融合仪。他过去使用化学的方法来进行的。怎么来推荐。
     
选择方案:如果费用允许, ECM 2001是最好的选择。它提供交流波能排列细胞,可以完成所有的细胞融合试验。如果费用不足的话,ECM830也可以完成核移植的工作,在融合时需要将两个细胞进行排列,或者细胞的浓度足够大。
     
以下是工作目的和相应的最佳仪器对照说明:
·细菌/酵母转化             (系统:ECM399/630)
     电穿孔现在被认作是转化细菌及酵母的最有效的方法。革兰氏阴性细菌(例如大肠杆菌)一般比革兰氏阳性细菌更容易转化,因为他们的细胞壁组成不同。对于革兰氏阴性细菌常常可以获得10的10次方转化2/微克DNA的转化效率,而对于革兰氏阳性细菌,一般可以得到10的6次方转化2/微克DNA。Chang等人(1997)成功对一个mtz-敏感的Heliobacter pylori菌株进行电穿孔以传递mtz抵抗性。Planelles等人(1999)使用电穿孔转化大肠杆菌,以避免使用包装物质。最近电穿孔仪器方面的进展将使研究人员能够进一步优化细菌转化(例如脉冲长度产生方面扩展的功能条件)。
     
     RNA、DNA、蛋白质以及小分子都已经通过电穿孔的方法转入酵母。没有必要在电穿孔前部分去除酵母细胞壁,因为在完整酵母电穿孔方面的进展可以产生高的转化率。Faber等人(1994)年优化了S.Cerevisiae的实验方案,使用Hansenula Polymorpha获得了比以前的报告增加300倍的转化效率。
     
     在质粒修复中,质粒从酵母转入大肠杆菌以进行详细的DNA序列分析,这是另外一种重要的技术。这种两个步骤的过程被电穿孔进行了简化,用于验证隐性基因的结构,将其导入酵母,看基因性和表现性之间的关系。已经建立了标准的实验方案使用指数衰减波发生器例如BTX ECM630转化细菌/酵母。使用方形波电穿孔仪的实验方案,例如BTX ECM830,来转化细菌/酵母。研究人员还成功将大的质粒(BAC及YAC)导入细菌。电穿孔杯是细胞及酵母电穿孔的最常用附件,而Model747共轴电极使用则变得越来越普遍。
     
·动物细胞转染    (系统:ECM630/830)
     对真核细胞的转染可以通过多种方法获得,例如磷酸钙沉淀、脂质体转染、病毒方法以及电穿孔。电穿孔已经被正式对传统的转染方法不灵的细胞有很好的效果,因此被选为最佳的分子传递系统。电穿孔的好处有可重复性、更高的效率、大量样本处理、无毒性以及容易使用(不需要孵育时间)。
     Lofin等人(1999)对NIH/3T3细胞进行电穿孔使mRNA进入,以研究细胞周期及细胞分化过程中mRNA对基因表达调节、控制。Bodwell等人(1999)在对COS-7细胞进行电穿孔是使用较长的脉冲时间后获得了较高水平的表达。Warner等人(1997)使用电穿孔方法成功转化了淋巴细胞。Incyte
Genomics公司成功使用BTX电穿孔仪转染了ES细胞进行转基因小鼠的生产。BTX ECM399\630\830型仪器、电穿孔杯以及多种特用的电极都用于动物细胞转染用途。
     
·蛋白质电整合/电插入   (系统:ECM630/830)
     将蛋白质导入细胞以及将蛋白质插入至细胞膜中也可以通过电穿孔来实现。不光肽段,而且包括抗体的多种蛋白,也可以进行导入。Ushio-Fukai等人(1998)对电穿孔插入哺乳动物细胞中的外源蛋白进行了定量。对于这些用途可以使用多种BTX电极。
     

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