生物医学光学技术（二）

表1 主要成像技术及应用场合（Nature Reviews 2002）
成像方法 主要应用场合
磁共振成像（MRI） 高对比度，用于表型、生理成像和细胞跟踪的最好的全方位成像系统。
计算机层析成像（CT） 肺和骨癌成像
超声成像 血管和介入成像
正电子发射断层成像PET 分子代谢，如葡萄糖，胸腺嘧啶核苷等的成像
单光子发射断层成像SPECT 探针，如抗体，肽等的成像
荧光反射成像FRI 表面肿瘤分子事件的快速成像
荧光介导层析成像FMT 对深部肿瘤靶向标记或“灵活的”荧光染料标记进行定量成像
生物发光成像BLI 基因表达，细胞追踪成像
活体显微成像 以更高分辨率实现上述所有参数成像，但测量深度和范围有限。

虽然在体光学成像技术在时/空分辨、实时、动态和多参数测量等方面有一定的优势，但仍然有大量的技术问题需要研究。例如，从光学标记角度看，如何针对所要研究的体系和对象，为实现在活细胞和动物体内监测基因表达及蛋白质—蛋白质的相互作用，发展特异性更高、更易于光学测量的核酸和蛋白质探针，是当前要解决的关键技术问题之一。

表2 常用成像技术及参数比较（Nature Reviews 2002）
成像方法 空间分辨率 时间分辨率 测量深度 造影剂 价格
MRI 10-100m Min/hrs 无限制 钆，镝和氧化铁离子 $$$
CT 50m Min 无限制 碘 $$
超声 50m Min mm 微型气泡 $$
PET 1-2mm Min 无限制 18F，11C，15O $$$
SPECT 1-2mm Min 无限制 99mTc（亚稳态锝）, 111In（铟） $$
荧光反射成像FRI 1-2mm Sec/min <1cm 荧光蛋白，近红外荧光染料 $
荧光介导层析成像FMT 1-2mm Sec/min <10cm 近红外荧光染料 $$
生物发光成像BLI 几mm Min cm 萤光素 $$
活体显微成像 1m Sec/min <400m 荧光蛋白，发光蛋白，近红外荧光染料 $$$
其中：$表示价格<10万美元；$$表示价格在10-30万美元之间；$$$表示价格>30万美元

表3简要介绍了近几年发展十分迅速、正受学术界高度关注的几种研究活细胞内基因表达与分子间相互作用动力学过程的光学成像技术的基本原理与特点，主要包括荧光共振能量转移（FRET）、荧光寿命成像（FLIM）、荧光漂白后恢复（FRAP）、荧光漂白后定位（FLAP）、荧光关联谱（FCS）和成像关联谱（ICS）等。如何发展和整合相关的成像方法，并应用于在体成像，为基因表达和蛋白质—蛋白质相互作用研究提供更先进的手段，也应是本项目研究的关键技术问题。
在数据处理与可视化研究方面，也存在重大的科学问题。例如，对于600微米左右的荧光，虽然可以穿透较厚的组织而被探测到，但由于经过了多次散射，如何定位发光位置，需要根据生物组织中的光子传输规律，通过图像重建算法来实现，事实上这方面的研究已经成为学术界的研究热点。例如，基于成像测量（包括光学成像）的分子与细胞事件动力学过程的可视化研究被评为2002年Science的十大突破之一（Science, Dec.20, 2002）。

表3 活体细胞内基因表达与分子间相互作用动力学过程的实时在体光学成像技术
名称 原理与应用
荧光共振能量转移FRET—Fluorescence Resonance Energy Transfer 供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移。FRET可用于测量分子内部间距，或蛋白质的不同反应活性部位、模型系统中的蛋白质与脂质、或细胞表面蛋白质等分子之间的距离。即可测量分子间的接近度，距离，方位和动力学特性。由于FRET效率与供体受体间的距离成6次幂的关系，所以FRET效率对距离的变化非常灵敏，可以灵敏测量10Å-100Å范围内的距离变化。

荧光寿命成像FLIM—Fluorescence Lifetime IMaging 荧光寿命成像显微镜和寿命测量与荧光浓度或激发强度的变化无关，FRET与FLIM的结合可提供高的空间（纳米）和时间（纳秒）分辨率。通过供体寿命测量和处理时间分辩图像，可精确计算相互作用的蛋白质间的距离。由于只测量供体荧光寿命，在FRET—FLIM成像中，可不考虑光谱的交叠问题。

荧光漂白（后）恢复 FRAP—Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP是研究蛋白质动力学的重要工具。在FRAP实验中，利用激光脉冲有针对性对被荧光蛋白标记的细胞内的一个小区域快速、不可逆地漂白。该漂白区域完全没有荧光信号。然后使用延迟显微镜测量荧光信号随时间的恢复情况。荧光的恢复是由未漂白的分子流入被漂白区域所造成的。因此荧光信号恢复的动力学过程含有了被标记蛋白的表观迁移信息。

荧光漂白（后）定位   FLAP—Fluorescence Localization After Photobleaching FLAP是在活细胞内对特定分子的光学标记进行定位和跟踪的新方法。被定位的分子包括两个荧光基团：一个被漂白，另一个则作为参考标记。与荧光漂白后恢复（FRAP）和荧光漂白中的损耗（FLIP）技术不同，利用参考荧光基团，通过简单的图像差异，即可跟踪光学标记分子自身的分布。因此，FLAP实际上可与光敏化方法相对比。与笼锁荧光探针方法相比，其主要优点是可用于跟踪细胞直接表达的嵌合荧光蛋白。