何龙飞1 、2 沈振国1 刘友良1 王爱勤2 (1 南京农业大学农学系,南京210095 2 广西大学农学院,南宁530004 )
膜片钳技术(patch2clamp technique ,PC) 是原西德马普所Erwin Neher 和Bert Sakmann 于1976
年发明的,他们首先将此技术应用于神经细胞的乙酰胆碱受体通道的研究,由于他们对这一技术及其在医学研究中的应用作出了杰出贡献,而荣获1991
年诺贝尔医学奖。八十年代以来,经过Hamill
等的进一步完善,加上原生质体、液泡等分离技术的成熟,膜片钳技术在植物细胞膜生物学和分子生物学研究得到广泛应用,并取得了丰硕成果。
1 膜片钳技术原理
膜片钳技术是从一小片(约几平方微米) 膜获取电子学方面信息的技术,即保持跨膜电压恒定—
电压钳位,从而测量通过膜离子电流大小的技术。进行膜片钳测量时,将经过抛光的、尖端直径为1 -2μm
的玻璃微吸管压在经酶清洁的膜表面,形成高阻封接,电阻可达10 -100
GΩ。由于电性能完全绝缘,微吸管阻抗相对较低,背景噪音降低,在微吸管内充灌适当盐溶液,同时施加电压,对膜片进行电压钳位,此时,通过膜片离子通道的电流便流入微吸管,再由银电极将该电流引入测量电路,再经过放大处理,便得到离子通道的离子流,从而能了解通过膜离子通道的离子运输、信号传递等信息。
由于玻璃微电极与细胞膜之间的高阻封接非常稳定和牢固,所以膜片钳可以采用多种测量方式(图1)
图1 膜片钳的几种测量方式
Cell2acttached :细胞粘附式
whole2cell :全细胞式
slow whole2cell :慢全细胞式
outside2out :外翻外式
inside2out :内翻外式
玻璃微吸管只是压在膜表面的测量方式称为细胞粘附式,在细胞粘附式基础上,如在微吸管内作短暂的脉动抽吸,吸破膜片,使微吸管与胞内导电,就形成全细胞式,全细胞式能对常规微电极不能研究的许多小细胞进行研究。全细胞式又有慢全细胞式和快全细胞式之分,前者主要用于研究药物对通道蛋白的影响,后者则用于研究细胞分泌。在全细胞式基础上,抽起微吸管,在空气中稍作停留,则可得到“内面向外和“外面向外的膜片,也称“切割膜片”,这些小膜片在化学性质上被完全隔离,允许任意改变膜内、外离子环境,
观察其对膜通道的影响,这种记录模式分别称为“内翻外式和“外翻外式。此外,还有“开放细胞吸附膜内翻外式(open cell2attched
inside2out mode) ”和“穿孔囊泡膜外翻外(perforated vesicle outside2out mode) ”等模式。
膜片钳记录到的是通道电流。图2 记录到的是悬浮培养Chenopodi u m rubru m 细胞液泡SV
型通道的单通道电流。单通道电流由矩形脉冲构成,是持续无规则的,反映出小分子构象变化。向上电流表示通道开放,向下表示通道关闭,其持续时间即通道开放和关闭时间。电流变化幅度表示离子在给定时间内通过通道的数目。通道开放和关闭的持续时间依赖于所施加电压和各种影响通道蛋白的因素(如Ca2
+ 1p H1 第二信使、磷酸化作用)
。对开放和关闭时间间隔及电流大小等进行统计分析,可得到通道蛋白的分子动力学特点,如确定通道类型,开放通道平均数离子流量等。目前,膜片钳技术的电流测量灵敏度已达P
安培(PA) 级,空间分辨率达1μm ,时间分辨率达10HS。
图2 Chenopodium rubrum 液泡膜SV 型通道的单通道电流记录
2 膜片钳技术在植物膜生物学研究中应用
自从利用膜片钳技术在植物细胞中证实离子通道的存在以来,膜片钳技术以其特有的优势而被广泛应用于植物膜生物学的研究。
物质运输
早已了解到生物膜上主要有三种转运蛋白:离子泵、通道和载体,但对它们在控制离子和代谢物质运输中的作用和分工一直了解不多,因为对它们的活动难以进行区别,尤其是载体协助扩散运输方式和离子通道都是沿浓度梯度或电位梯度进行的顺势流动,区别起来更为困难。利用膜片钳技术已经能分辩出离子通道和载体间的差异:载体蛋白最大周转率为104
-105 次/ 秒,即每秒钟运输104 -105 个离子;离子通道每秒可传递多于106 个离子,一个典型离子通道每秒可通过107
个离子,二者运输速率相差100 -1000 倍[ 3 ]
。因此,应用膜片钳技术可以区别物质通过膜的运输方式。利用膜片钳技术,已证实在植物细胞中存在许多种类离子通道,如K+ 通道、Ca2 + 通道、Cl
-通道、NO3 -通道、有机酸离子通道(如苹果酸) 等,并了解了其生理特性,加深了对植物进行营养物质吸收和运输的认识。
信号转导
细胞信号转导,尤其是逆境信息的感受和传递一直备受关注,但对其分子机制一直了解不多。近年来,
利用膜片钳技术结合其它手段,大大加深了对这一问题的认识。逆境(如干旱、盐)
胁迫下,通常引起植物叶片气孔关闭,用膜片钳和其它手段,已较清楚地了解这一过程的作用模式:逆境条件下,根尖合成ABA ,
通过导管向地上运输,到达叶片细胞质外体,ABA 激活保卫细胞质膜上的非特异阳离子通道,Ca2 + 内流,使胞质Ca2 +
浓度增加,到达一定水平后,激活K+ 外流通道,引起K+ 迅速大量外流,苹果酸含量下降,保卫细胞膨压丧失,气孔关闭。
应用膜片钳研究植物对病虫害侵袭的防御反应也取得较大成功。用水稻特异激发子处理烟草时,真菌激发子诱导激活烟草细胞质膜上的Ca2 +
通道,提高通道开放机率,Ca2 + 内流增加,导致胞内Ca2 + 浓度上升, 激活植物防御反应系统, 阻止细胞死亡, 接着, 胞质Ca2 +
继续激活蛋白激酶,引起级联反应,使质膜H+ ¬A TPase 再磷酸化,从而恢复正常细胞功能 。
细胞分泌
由于膜片钳技术灵敏度高,用其并结合细胞生理学与分子生理学等技术来研究细胞分泌机制是非常新颖有效的手段。其原理在于细胞分泌的胞吐过程是在细胞膜上进行的,它会引起细胞形态的改变和物质流动,从而导致膜片参数发生变化,尤其是伴随着分泌活性,整个细胞表面积(与膜电容成正比)
必然增加,通过测量细胞膜电容,便可估计单细胞的分泌活性[ 5 ]
。在动物细胞中,通过膜片钳实验,已初步得到了肥大细胞分泌调控模型、嗜铬细胞分泌调控模型,而植物细胞则较少有报道,可能与植物细胞分泌时引起表面积变化相对较小,不易清楚区分有关,相信不久会有所突破。
分子生物学研究
膜片钳技术也是研究转运蛋白基因克隆、表达和功能分析的有效手段。将转运蛋白基因的cRNA
注射入卵母细胞,在卵母细胞内便合成转运蛋白,并以功能状态整合到细胞膜上,再应用膜片钳分析,便可证实该基因结构与功能间的一致性。如利用注入不同量KA
T1 的cRNA 以控制KA T1 在卵母细胞中的表达, 膜片钳记录到K+ 内流量随入cRNA 量增加而上升, 再加入外源的K+
内流通道阻塞剂,发现其抑制常数随注入的cRNA 量由015ng 增加到28ng 而增加了7 倍,说明KA T1 属于K+ 内流通道[ 6 ]
,在此基础上还可对其功能作进一步分析。用这一方法,对氨基酸、蔗糖、N H4 + 、脯氨酸等的转运蛋白进行了深入的分析。
此外,膜片钳技术还可用于转运蛋白的遗传特性、突变体和转导植株分析 ,以及转运蛋白分子运动、物质运输的动力学性质的研究。
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