本期推荐的是发表在 Journal of Analysis and Testing 2020年第3期的中国医学科学院药物研究所张金兰研究员团队原创论文“基于UHPLC-Q-TOF-MS的脑胶质瘤大鼠中酸性鞘糖脂代谢紊乱和替莫唑胺抗脑胶质作用的研究”。敬请阅读。
酸性鞘糖脂（Acidic glycosphingolipids, AGSLs）是神经组织中高度丰富的鞘糖脂，分为神经节苷脂和硫苷脂两大类。神经节苷脂由一分子神经酰胺和一分子含唾液酸的寡糖链组成，是目前发现的结构最复杂、种类最多的一类脂质化合物。根据神经节苷脂寡糖链中唾液酸数量的不同，可将神经节苷脂分为GM、GD、GT和GQ系列，分别表示寡糖链中含有一个到四个唾液酸分子；寡糖链中单糖数目的差异通过不同的数字表示，如GM系列包括GM1、GM2和GM3；唾液酸连接方式的不同，通过在数字后加上小写英文字母加以区分，如GD1包括GD1a和GD1b。硫苷脂是由一分子的硫酸基团和一分子半乳糖基神经酰胺组成。脑组织的发育和中枢神经系统疾病等均被报道与AGSL密切相关。本研究基于实验室已建立的酸性鞘糖脂分析方法，分析脑胶质瘤大鼠血浆和脑组织中不同AGSL化合物的变化，研究脑胶质瘤大鼠AGSL化合物代谢紊乱特点和替莫唑胺抗肿瘤的作用，深入地认识其药效作用特点和机制。
采用大鼠右侧纹状体定位注射大鼠脑胶质瘤C6细胞，建立大鼠脑胶质瘤模型。手术后第11天，所有大鼠进行小动物核磁共振（MRI）评价，观察肿瘤生长情况。选择造模成功的10只大鼠随机分为2组，每组5只，分别为模型组和替莫唑胺组。此外，另有5只注射空白细胞培养基的大鼠作为假手术组。从手术后第11天起，替莫唑胺组大鼠每日灌胃给予替莫唑胺给药液（20 mg/kg），连续5天。手术后第18天，所有大鼠再次进行MRI评价，记录肿瘤生长情况。第二次MRI评价后，进行大鼠血浆和脑组织样品的取材。大鼠脑组织进行肿瘤组织、癌旁组织（距离肿瘤组织小于2 cm）和正常脑组织的分离。各组织在液氮中冷冻后，分别置于-80℃冰箱保存。
脑组织匀浆液或血浆前处理后进行UHPLC-Q-TOF-MS分析。仪器使用Agilent 1290 UPLC和6550 Q-TOF系统。色谱柱为Agilent Zorbax Eclipse PlusC18 column (2.1×50 mm, 1.8 µm)。流动相A为含0.2%甲酸和10mM甲酸铵的水溶液，流动相B为含0.2%甲酸和10mM甲酸铵的甲醇溶液，以0.4 ml/min进行梯度洗脱。柱温设置45 ℃，进样体积为10 μl。质谱采用ESI源，正离子模式检测。扫描范围为600-2000 Da，MS/MS碰撞能量为20、40和60 eV。
使用Agilent MassHunter Q-TOF定量分析软件进行色谱峰积分。采用内标法计算各个化合物的相对含量，d3-GM3 (d18:1/18:0) 和d3-sulfatide分别作为神经节苷脂和硫苷脂的内标。采用BCA法测定脑组织蛋白浓度，用于脑组织中AGSL化合物浓度校正。采用SPSS 软件中的Shapiro-Wilk检验代谢物数据是否符合正态分布，对符合正态分布的变量采用T-检验，对不符合正态分布的变量采用Mann-Whitney U检验，寻找组间有显著性差异的化合物，界定显著性差异的临界值为P<0.05。采用Simca.P软件对所有数据进行正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)寻找潜在生物标志物。提取生物标志物的标准如下：(1)投影中的变量重要性值(VIP)大于1；(2)Jack-knife不确定区间不跨越0点；(3)S-plot中的Pcorr的绝对值大于0.58。
本研究基于实验室已建立的酸性鞘糖脂分析方法，该方法能将具有不同寡糖链的神经节苷脂同分异构体在反相色谱柱上进行分离。使用该方法在大鼠肿瘤、癌旁和正常脑组织中分别定量143、142和142种AGSL化合物，其中141种AGSL化合物在各组织间一致。发现大鼠脑组织中多数AGSL化合物中的鞘氨醇主要以C18-和C20-形式存在。GD1a, GD1b, GM1和GT1b、GM3是脑组织含量最高的五类神经节苷脂（图1），其含量总和占到脑组织神经节苷脂总量的88-89%，这与此前文献报道的结果一致。
图1 大鼠脑组织中AGSLs种类的分布。a正常大鼠脑组织中检测到的AGSLs的TIC图；b癌旁组织中AGSLs的TIC图；c肿瘤组织中AGSLs的TIC图；d正常大鼠脑组织中检测到的AGSLs的EIC图。e、癌旁组织中AGSLs的EIC图；f肿瘤组织中AGSLs的EIC图；g正常大鼠脑组织中AGSL种类的饼图；h癌旁组织中AGSL种类的饼图；i肿瘤组织中AGSL种类的饼图。j 不同样本间AGSL的维恩图。
OPLS-DA分析显示假手术组、模型组和替莫唑胺组有显著区分（图2）。
图2 C6胶质瘤大鼠肿瘤、癌旁和正常脑组织中AGSL化合物OPLS-DA分析的得分图。
潜在生物标志物主要存在于GD1a，GD1b，GM1， GM3和硫苷脂中（图3）。
图3 大鼠C6胶质瘤模型的潜在生物标志物 a大鼠肿瘤组织中的潜在生物标志物；b癌旁组织中的潜在生物标志物；c正常脑组织中的潜在生物标志物。*，Sham vs. Model；#，Model vs TMZ；单标：P＜0.05，双标：P＜0.01
使用潜在生物标志物构建脑胶质瘤引起的酸性鞘糖脂代谢紊乱及替莫唑胺调节作用的相关代谢网络，如图4所示。GM1在维持神经元稳态和控制核内Ca2+方面起着重要作用。该作用通过调节细胞信号通路，如Na+/Ca2+交换器和ERK1/2磷酸化等影响神经功能。
图4 TMZ对大鼠C6胶质瘤引起的AGSL紊乱的调控。
GM1可能诱导神经发生，促进细胞分化，对受损神经元起到神经保护和神经修复作用。此外，GM1制剂可帮助脑肿瘤动物改善神经元功能。给予TMZ后，大鼠癌旁组织中GM1(d18:0/16:0)和GM1(d18:1/17:0)的水平显著上调，GM1的代谢产物GD1a(d18:0/16:0)在癌旁组织中也有明显的上调，表明GM1可能参与C6胶质瘤引起的神经损伤修复。中枢神经系统的细胞增殖、粘附和分化受GM3调控。GM3可抑制EGF、PDGF和FGF受体的酪氨酸磷酸化，从而抑制细胞增殖。GM3还通过抑制EGF和FGF受体，降低胶质瘤细胞的运动性。此外，GM3还通过影响细胞粘附及其与ECM蛋白的相互作用，抑制癌细胞的入侵。用TMZ治疗后，大鼠肿瘤组织中GM3（d18:1/22:0）/GM3（d20:1/20:0）的含量明显增加，这可能是TMZ抑制C6胶质瘤的原因之一。硫苷脂参与各种生物过程，包括细胞粘附和生长、信号转导、神经元可塑性和蛋白质贩运。硫苷脂也是中枢和外周神经系统髓鞘的主要脂质成分其表达在许多肿瘤中高度上调，替莫唑胺可能通过降低硫苷脂的水平从而发挥抗肿瘤的作用。
本研究首次从AGLS调控的角度研究了TMZ的抗肿瘤作用。证实了脑胶质瘤导致AGSL紊乱的假说。此外，TMZ可能通过调节GM3、GM1、GD1a和硫化物的水平发挥抗胶质瘤的作用。
张金兰研究员简介
张金兰 博士，研究员，博士研究生导师，北京协和医学院药物分析学系副系主任。
1992年于北京医科大学（现北京大学医学部）获理学学士学位；1995年于中国协和医科大学（现北京协和医学院）获理学硕士学位；2002年于中国协和医科大学（现北京协和医学院）获药物分析学博士学位。
1992年至今，一致从事药物分析和药物代谢的研究工作，1995年以来作为课题负责人承担和完成了10余项国家和省部级研究课题，2009年度入选教育部新世纪优秀人才计划。
主要研究方向包括：药物分析新技术与方法研究；中草药有效成分分析和代谢研究；代谢组学/脂质组学分析新技术研究和应用；新药质量标准和代谢研究。
担任《中国药学》（英文版）、《药物分析杂志》、《质谱学报》、Journal of Separation Science编委。中国质谱学会常务理事；全国生物计量技术委员会委员；中国分析测试协会青年学术委员会顾问；中华中医药学会中药资源分会委员；中国医药生物技术协会药物分析技术分会常务委员；中国实验室合格评定委员会（CNAS）实验室认可评审员；国际反兴奋剂组织（WADA）实验室认可评审员。
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