学习琼脂糖凝胶电泳的基本原理；
（2） 掌握使用水平式电泳仪的方法；
（3）掌握核酸琼脂糖凝胶电泳的基本操作
2实验原理
琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相比于蛋白质太大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。
核酸是两性电解质，其等电点为pH2-2.5，在常规的电泳缓冲液中（pH约8.5），核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时，具有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。因此，核酸分子的迁移率由下列几种因素决定：
1
DNA的分子大小。
线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中移动，因而迁移得越慢。
2
DNA分子的构象。
当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋质粒DNA在琼脂糖凝胶中移动的速度是不一样的，超螺旋DNA移动得最快，而开环状DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上出现相同的DNA图谱，则为同一种DNA。
3
电源电压。
在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb 的DNA 片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。
4
离子强度影响。
电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶），电导率最小，DNA几乎不移动；在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。
溴化乙啶能插入DNA分子中形成复合物，在波长为254nm紫外光照射下EB能发射荧光，而且荧光的强度正比于核酸的含量，如将已知浓度的标准样品作电泳对照，就可估算出待测样品的浓度。
常规的水平式琼脂糖凝胶电泳适合于DNA和RNA的分离鉴定；但经甲醛进行变性处理的琼脂糖电泳更适用于RNA的分离鉴定和Northern 杂交，因为变性后的RNA是单链，其泳动速度与相同大小的DNA分子量一样，因而可以进行RNA分子大小的测定，而且染色后条带更为锐利，也更牢固结合于硝酸纤维素膜上，与放射性或非放射性标记的探针发生高效杂交。
3仪器及试剂
1.仪器及耗材:
水平电泳槽,电泳仪,凝胶成像分析系统,微波炉,微量移液器,透明胶带,点样或parafilm,100 ml或250 ml锥形瓶,量筒,吸头等.
2.试剂及配制:
50×TAE缓冲液的配制:2 mol/L Tris-乙酸,0.05 mol/L EDTA(pH 8.0)
配制1000 ml
Tris 242 g
冰乙酸 57.1 ml
0.5 mol/L EDTA 100 ml
加入600 ml去离子水后搅拌溶解,将溶液定容至1 L后.高温高压灭菌,室温保存.
1×TAE缓冲液的配制:
称量20 ml的50×TAE缓冲液,再加入980 ml的去离子水.
溴化乙啶贮存液:10 mg/ml 溴化乙啶
配制:100 ml
称取1 g溴化乙啶,置于100 ml烧杯中,加入80 ml去离子水后搅拌溶解.将溶液定容至100 ml后,转移到棕色瓶中.室温保存.
6×上样缓冲液:0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯青FF,30%甘油.
配制:10 ml
溴酚蓝 25 mg
二甲苯青FF 25 mg
甘油 3 ml
用6×TAE缓冲液定溶至10 ml,分装成1 ml/管.-20℃保存.
其它试剂:DNA样品,DNA Ladder ,琼脂糖,
4操作步骤
1
制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml):称取0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液.
2
胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止.
3
加样:在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X.用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.
4
电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳。
5
电泳完毕后,取出凝胶,用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1×TAE溶液染色约20 min,再用清水漂洗10 min。
6
观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存。
5常见问题及注意事项
（1）配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶.
（2）琼脂糖凝胶易于破碎,操作时要轻缓.
（3）电泳时应注意电源线路,预防触电.
（4）溴化乙淀具有致癌作用,配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套.并在专门的实验室内使用.
（5）紫外线对人体有损伤作用,开灯时间不宜太长,注意防护.
（6）DNA带形状模糊:DNA加样过多；电压太高；凝胶中有气泡.
（7）质粒DNA的存在形式有3种,①共价闭环DNA(cccDNA),常以超螺旋形式存在；②开环DNA(ocDNA),此种质粒DNA的两条链中有一条发生一处或多处断裂,因此可以自由旋转从而消除张力,形成松弛的环状分子；③线状DNA,因质粒DNA的两条链在同一处断裂而造成.因此质粒DNA电泳的结果中有可能出现三条泳带,它们的泳动速度为:cccDNA > 线状DNA > ocDNA.
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