实验方法原理 同 Chomczynski 和 Sacchi 两人于 1987 年报道的 RNA 快速提取法一样，这种方法包括用含异硫氰酸胍和酚的一种单相液来裂解细胞。加入氯仿产生了第二相（有机相），DNA 和蛋白质在有机相中被抽提，RNA 则被留在上层水相中。
实验材料 源细胞或组织
试剂、试剂盒 氯仿乙醇异丙醇液氮单相裂解试剂磷酸缓冲盐溶液RNA 沉淀液乙酸钠
仪器、耗材 Sorvall H1000 转头或与之相当的转头Sorvall SS-34 转头或与之相当的转头比色杯匀浆器研钵和研杵带螺帽的聚乙烯管水浴
实验步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
氯仿
乙醇
异丙醇
液氮
单相裂解试剂
磷酸缓冲盐溶液（PBS), 冰冷
RNA 沉淀液（1.2 mol/L NaCl，0.8 mol/L 柠檬酸二钠盐·15H2O（不需要调 pH）
乙酸钠（3 mol/L, pH 5.2)
2. 细胞和组织
源细胞或组织
3. 离心机和转头
Sorvall H1000 转头或与之相当的转头
Sorvall SS-34 转头或与之相当的转头
4. 专用设备
测量 260 nm 吸光度的比色杯
匀浆器（如Tekmar-Dohrmann 的组织匀浆器和 Brinkmann 的 polytron 匀浆器）
研钵和研杵
带螺帽的聚乙烯管
水浴，预设定 65℃
二、方法
1. 准备分离 RNA 的细胞或组织样品
(1) 组织
① 解剖所要的组织，将其直接放入液氮中速冻。
② 将 100 mg 冰冻组织放液氮的研钵中，用研杵碾碎组织。在研磨过程中要不断添加液氮以保持组织冷冻。
③ 将粉末状的组织移入一个盛有 1 ml 冰冷单相液的聚乙烯螺帽管中。
④ 于室温用 polymm 匀浆器高速匀浆组织 15~30s。
(2) 悬浮生长的哺乳动物细胞
① 用台式离心机于室温以 200~900 g（Sorvall H1000 转头为 1000~3000 r/min) 离心 5~10 min, 收集细胞。
② 吸出培养液，用 1~2 ml 无菌冰冷的 PBS 重悬细胞沉淀。
③ 离心收集细胞，吸尽 PBS, 每 106 细胞加 1 ml 单相裂解剂。
④ 于室温，用匀浆器高速匀浆细胞 15~30s。
(3) 单层生长的哺乳动物细胞
① 吸出培养液，用 5~10 ml 无菌冰冷的 PBS 洗涤细胞一次。
② 吸出 PBS, 每个直径 90 mm 培养皿中的培养细胞用 1 ml 单相裂解剂裂解细胞（每个直径 60 mm 培养皿加 0.7 ml 单相裂解剂）。
③ 转细胞裂解液于一螺帽聚乙烯管中。
④ 于室温用匀浆器高速匀浆细胞裂解物 15~30s。
2. 于室温将细胞匀浆物温育 5 min 使核蛋白复合物完全解离。
3. 加入 0.2 ml 氯仿于每毫升单相裂解剂中，通过剧烈摇动或用旋涡震荡器混匀样品。
4. 于 4℃ 以 12000 r/min （Sorvall SS-34 转头 10000 g）离心 15 min 使混合物分为两相， 将上层水相移至一个新的离心管中。
5. 从水相中沉淀 RNA: 每 1 ml 单相裂解剂，加入 0.25 倍体积的异丙醇和 0.25 倍体积的 RNA 沉淀液。充分混匀后，于室温放置 10 min。
6. 于 4℃ 以最大转速离心 10 min 收集 RNA 沉淀。用 75% 的乙醇洗涤沉淀两次，重复上述离心。用一次性使用的吸头吸尽残存的乙醇。将打开管盖的离心管在实验台放置几分钟，让最后残存的痕量乙醇挥发殆尽。不要让 RNA 沉淀干透。
7. 加 50~100 μl DEPC 处理过的水。将 RNA 溶液贮存于 -70℃。
加 SDS 至终浓度 0.5%，然后加热至 65℃ 有助于 RNA 沉淀的溶解。
8. 估计 RNA 的浓度
首页
