离心机和转子

Sorvall RT6000 离心机，H1000B MPC 和 H6000A MPC 转子（离心微量滴定板用）

专用设备

玻璃珠（直径 0.45 mm, 无菌；Sigma)

微量滴定板（24 孔或 96 孔 [可选])

重复用移液管

可选，请参见步骤 1。

附加试剂

此方案的步骤 2 需要第 1 章方案 26 中列出的电穿孔试剤。

此方案的步骤 3 和 4 需要第 1 章方案 1 中列出的小量质粒 DNA 制备用试剂。

此方案中步骤 10 需要第 4 章方案 13 中列出的酵母 DNA 测序试剂。

载体、细菌和酵母菌株

适用于电穿孔的大肠杆菌 DH5a 或大肠杆菌 KC8(pyrF leuB600 trpC hisB463;CLONTECH)

请参见第 l 章，方案 26。

非特异性诱饵质粒

请参见步骤 6 说明。

PMW112，pRFHM-1

pBait(来自第一阶段）

在 CM(Glu)-Ura-His-Trp 主极上生长的具适当表型的酵母克隆（第二阶段步骤 21 已鉴定）

酵母菌株 EGY48

方法

阳性质粒的分离提供了两种分离离散文库质粒的方法。分离少量的菌落时，将细胞在 SDS 中裂解；分离大量的菌落时，细胞用酶解酶（zymolyase) 裂解。

(1) 从阳性菌落中制备细胞裂解物

1) 少量菌落的分离

一般来讲，即使阳性菌落的数目数以百计，一些研究人员也宁愿用这种方法去逐步处理最初得到的全套阳性菌落，而在同时处理约 24~36 个或更少的菌落时，这种方法则是最为好用的。在通常的情况下，利用这个方案结束处的替代方案从普通生长的阳性菌落中区别出单一序列，不失为一个较为有效的方法。

a. 从 CM(Glu)-Ura-His-Trp 主板开始（第二阶段步骤 21), 挑取在选择培养基上呈现合适表型的菌落至 5 ml 的色氨酸缺乏的葡萄糖培养基中，30°C 过夜培养。在这种情况下省掉-Ura-His 筛选可以促进非文库质粒的丢失，使分离希望得到的文库质粒变得更为容易。

b. 室温下使用小型离心机以最大转速离心毎个培养液中的 1 ml 培养物 1 min, 在 200ul 的 STES 裂解液中重新悬浮沉淀，加入 100ul 直径 0.45 mm 的无菌玻璃珠，剧烈振荡试管 lmin。

c. 每个试管中加入 200ul 平衡酚，再次剧烈振荡 1 min。

d. 室温下使用小型离心机以最大转速离心乳浊液 2 min, 分别把水相转移至新的小离心管中。

e. 每个水相中加入 200ul 的平衡酚和 100ul 的氯仿，振荡 30s。室溫下使用小型离心机以最大转速离心乳浊液 2 min, 分别把水相转移至新的小离心管中。

f. 每个水相中加入两倍体积（400ul) 的乙醇，翻转混合，-20°C 冷冻试管 20 min,4°C 条件下使用小型离心机以最大转速离心 15 min 来回收核酸。

g. 弃去上清。用冷的 70% 乙醇洗涤沉淀，真空条件下使沉淀大致干燥后，在 5~10ul TE(pH8.0) 中重新悬浮每份沉淀。进行步骤 2。

2) 大量菌落的分离

下面制备多批 DNA 的实验方法是由 Steve Kron(芝加哥大学）建立的，在它是对 Manuel Claro(巴黎基因技术分子实验室）最初建立的实验方案的一种放大。需要带有平板固定器（或托盘、支架）的冷冻离心机和可以重复使用的移液管。

a. 在 24 孔微童滴定板的每个孔中加入 2 ml 2xCM(Glu)-Trp 培养基。用牙签从主板上挑取假定的阳性克隆到微量滴定板的孔中（第 2 阶段步骤 21),30°C 摇动微量滴定板培养过夜。

使用 2X 基础培养基增加了酵母的产通常可以方便地处理 4 个平板，并在一个离心机中同时离心。

b. 使用带有平板支架的离心机，4°C、1500 g(使用 Sorvall H1000B MPC 转子 3000r/min) 离心 5 min。用手甩动平板去掉上清液，平板正面向上放置，摇动或轻轻振荡平板使细胞沉淀重新悬浮于保留的培养液中。每个孔中加入 1 ml 水轻轻播动平板。

加入新的溶液之前，细胞沉淀最容易重新悬浮于残余的液体中。可以使用重复用移液管添加溶液。

c. 如步骤 b 般离心，甩掉上清液，重新悬浮细胞沉淀于残留的上清液中，加入 lml 的拯救缓冲液。

d. 如步骤 b 般离心，甩掉上清液，重新悬浮细胞沉淀于平板上少量的残留上清液中，每个孔中加入 25ul 的裂解液，摇动或振荡平板，在旋转摇床上 37°C 培养平板（需加盖）约 1 h。

裂解液使用前不需要完全溶解。经过 1 h，酵母细胞凝结为白色的沉淀时，即明显可见裂解现象。酵母菌株对裂合酶的敏感性各不相同。如果裂解现象出现得很快，那么就使用较少的裂合酶。如果裂解处理的时间过长, 过多的部分溶解细胞垫将可能污染最后的材料。可以通过在相差显微镜下检査细胞来判断裂解情况。活细抱是带有黑的晕圈的白色，死细胞是均匀的灰色。裂解会把细胞中的顆粒内容物释放到培养基中。一旦细胞大部分都变成灰色并且许多细胞已经破裂，即可假定为许多质粒已经释放了出来。

e. 每个孔中加入 25ul 的 10%SDS。摇动平板完全溶解沉淀。室温下把平板在桌面上放置 lmin。1 min 后，平板上的孔中应为清亮的、稍微黏稠的溶液。

f. 每个孔中加入 l00ul 的 7.5mol/L 乙酸铵。轻轻振荡平板，然后-70°C 或-20°C 放置 15 min 直到裂解物被冷冻为止。

乙酸盐的加入导致了细胞碎屑和 SDS 块状沉淀的形成。冷冻步骤促进了大扬杆菌转化抑制物的去除。

g. 从冰箱中取出平板。一旦开始融解，4°C、3000 g(使用 Sorvall H6000A MPC 转子 3800r/min) 离心 15 min, 转移得到的 100~150ul 的清亮上清液至新的 24 孔板中。

要点：一般来说，沉淀材料对上清液的某些污染不能避免。然而为了保证纯度，最好牺牲部分产物。

h. 每个孔中加入约 0.7 体枳的异丙醇，摇动平板混合溶液，室溫下沉淀核酸 2 min。按照步骤 g 离心，用手甩动平板去掉上清液。

异丙醇加入后马上出现浑浊的细小沉淀。

i. 每个孔中加入 1 ml70% 冷乙醇，晃动平板。然后 4°C、3000 g(使用 Sorvall H6000A MPC 转子 3800r/min)5 min, 用手甩动平板去掉上清液，翻转平板，让孔印在纸巾上，让平板在空气中干燥。

j. 每个孔中加入 100ul 的 TE(pH8.0)。晃动平板，然后放在桌面上放置几分钟，直到沉淀完全掖解。把制备品转移至小离心管或 96 孔板孔中-20°C 保存。进行步骤 2。

取每份所得制备品来通过电穿孔转化适宜的大肠杆菌。如果没有得到足够的菌落，重新沉淀 DNAs, 再溶解于 20ul 而不是 100ul 的 TE 中, 浓缩 DNA 贮存液。

转化至大肠杆菌中

如果诱饵蛋白被克隆在携带氨苄青霉素抗性标志的特异性 lexA 融合质粒（表 18-1) 中，一定比例的大扬杆菌 DH5a 转化子将不含这个文库质粒。解决这个问题的一个方法是分析每个 DNA 制备品的多个转化子。另一个行得通的方法是通过一株具有 trpC 突变的大肠杆菌传递质粒，通过酵母 TRP1 基因补足大肠杆菌 trpC 突变的能力来筛选文库中的质粒。

(2) 通过电穿孔的方法在感受态大肠杆菌 DH5a 或菌 KC8(pyrF leuB600 trpC hisB463) 中引入 1~5ul 的质粒 DNA 制备品，把细菌铺在含有 50ug/ml 氨苄青霉素的 LB 琼脂板上，37°C 孵育过夜。

(3) 如果质粒 DNA 转入了，则进行步骤 4, 如果质粒 DNA 转入了 KC8 中，则：

a. 在 LB/氨苄青霉素平板上重新划线培养，或复制平板将菌落转移至细菌用基础培养基（色氨酸缺乏)，37°CC 孵育细菌过夜。

在这些条件下生长的菌落含有 PJG4-5 文库质粒，此质粒携带的 TRP1 基因有效地补足了细菌 trpC9830 突变。

转化混合物一开始铺在 LB/氨苄青霉素平板上比直接铺在细菌用基础平板上的生存压力要小，增加了所得的菌落数，

b. 从一个分离的菌落制备小量的 DNA，按步骤 2 所述利用这些 DNA 转化细菌 DH5a 细胞。

KC8DNA 的小量制备可用于酵母的限制性酶切、PCR 和重新转化。然而，我们建议在打算测序之前，使用 KC8 的小量制备 DNA 来转化更加容易接受的大肠杆菌株，如 DH5a。KC8 制备的 DNA 通常不适合用来进行双脱氧或自动测序，即使在充分的纯化之后情况也是一样。

(4) 从携带文库质粒的 DH5a 细胞制备小量的 DNA。

要点：一般来说，从原始的阳性相互作用子产生的两个或三个单独的细菌菌落制备 DNA 是一个很好的主意。相对于细菌来说，酵母能够耐受重复多次的带有相同选择标志的 2u 庾粒。如果一个单个酵母细胞含有两个或三个不同的文库质粒，其中只有一个质粒编码了相互作用蛋白质，相关的 cDNA 克隆在质粒的分离阶段就可能丢失。再者，一般来说，这不是主要问题，平均大概 10% 的酵母细胞将含有两个或更多的文库质粒。

(5) 通过对含有相同插入片段的阳性克隆制备的重复样品来进行限制性酶切分析确证和/或确定是否重复分离到了小量的 cDNAs。

携带 EcoRⅠ+I 的文库质粒分解时将释放 cDNA 的插入片段，而携带有 EcoRI+XhoⅠ+HaeⅢ的文库质粒分解时将“指示”不要绝望。全部阳性菌落中只有少量的生长时，或相互作用子 cDNA 在文库中的丰度很低时，真正的相互作用子已经作为单一的阳性克隆被得到。

重要：一些研究人员在这个时候会对 DNAs 进行测序。大量的钱可能浪费在了非特异性相互作用子的测序上，我们强烈建议测序之前应该完成下面所述的酵母转化和特异性检测。

阳性相互作用的第二次确证：重复表型和特异性检测

相互作用蛋白特异性的最终检测是把来自大肠杆菌的文库质粒重新转化到含有“处女型” lexAop-LEU2/lexAop-lacZ/pBait 的菌株中其目的是验证是否依然可以观察到依赖相互作用的表型和依然对原来的 pBait 存在特异性。这次验证将消除假阳性，包括在半乳糖培养基生长或活化转录的原始转化酵母 EGY48 中的突变、与 lexA DNA 结合域相互作用的文库编码 cDNAs 以及"黏稠的"并与多个 pBait 混合相互作用的文库编码蛋白。

(6) 用下面的几组质粒转化酵母株 EGY48, 在 CM(Glu)-Ura-His 平板上筛选菌落。

a.pMW112 和 pBait

b.pMW112 和 pRFHM-1

c.pMW112 和一个非特异性诱饵蛋白

如果筛选中最初使用的 pBeil 能够激活转录，即使很轻微，我们强烈地推荐对照诱饵也应该是能微弱地活化转录的非特异性对照诱饵。一般来说，微弱地激活转录的诱饵很难与假阳性的背景相区分。一些假阳性也通常与微弭活化的 LexA 融合蛋白发生相互作用。

(7）2~3d 后就可以使用由步骤 6 所得的转化酵母。使用电穿孔的方法把得自大肠杆菌 KC8 和 DH5a 的质粒引入单个的转化子 a~c 中。把转化混合物铺在 CM(Glu)-Ura-His-Trp 平板上，30°C 孵育平板直至菌落长出（2~3d)。

重要：阴性对照也可以作为带有 pJG4-5 文库载体转化子 a~c 的电穿孔样品。

(8) 为每个需要检测的文库质粒制作一块 CM(Glu)-Ura-His-Trp 主板。通常情况下，最接近的文库质粒转化子 a~c 在平板上划线培养有助于简化非特异性相互作用单元的检测。

重要：毎一个平板也应该包含转化了 pJG4-5 阴性对照的 a~c 系列。

(9) 正像第二阶段步骤 21 所描述的那样，检测β-半乳糖苷酶活性和亮氨酸营养缺陷型。

(10) 分析这些特异性检测的结果，并对所得阳性分离物进行测序（请参见第 4 章方案 13)。