试剂、试剂盒 乙酸铵氯仿异戊醇DMSO乙醇NaOH酚测序反应缓冲液琼脂糖凝胶寡核苷酸引物闭环双链质粒 DNA

仪器、耗材 干冰-乙醇浴65°C 水浴

实验步骤

材料

缓冲液和溶液

试剂、缓冲液、储液的组成参见附录 1, 储液使用前稀释到适当浓度。

乙酸铵（5mol/L, 非缓冲，pH~7.4)

氯仿：异戊醇（24:1,V/V)

DMSO

可选用，请参见步骤 10。

乙醇

NaOH(2mol/L)/EDTA(2 mmol/L)

使用前将 10mol/L 氢氧化钠储液稀释到合适浓度。

酚，用水或 TE(pH7.6) 平衡。

测序反应缓冲液

凝胶

琼脂糖凝胶（0.8% m/V)

核酸和寡梭苷酸

寡核苷酸引物

变性双链 DNA 模板测序所用寡核苷酸引物一般比单链 DNA 模板测序所用引物要长 20~30 个核苷酸。

变性双链 DNA 模板测序使用长引物可以减少假带的出现。

结合靶区域上游载体序列的通用引物表见第 8 章信息栏“通用引物”，并参阅本章信息栏“DNA 测序引物储液配制”。

闭环双链质粒 DNA

从培养菌体中小规模或大规模制备质粒 DNA 方法见第 1 章，也可以按照本方案后面的备选方法进行。

四组一套的测序反应（ddA,ddG、ddC、ddT) 需要 5ug DNA。

专用设备

干冰-乙醇浴

65°C 水浴

方法

1. 取 5ug 纯化质粒 DNA 加至 1.5 ml 微量离心管中，补加水至总体积为 50ul。加入10ul 新配制的 2mol/LNaOH/2 mmol/LEDTA 溶液，室温放置 5 min。

2. 加入 30ul 5mol/L 乙酸铵，涡旋振荡混匀。

3. 加入 45ul 平衡酚，涡旋振荡混匀。

4. 加人 135 氯仿: 异戊醇，涡旋振荡混匀。然后在室温下用微量离心机以最大转速离心 15 min。

5. 小心吸取上层水相至一干净微量离心管中，加入 330ul 冰预冷乙醇，混匀。置于干冰-乙醇浴中，放置 15 min。

6. 在下用微量离心机以最大转速离心 15 min, 回收变性 DNA。

7. 仔细倾去上清液，不要搅动 DNA 沉淀，DNA 沉淀在管壁上可能看得见，也可能看不见。

8. 重新离心 2S，用 Tip 头将残存的痕量乙醇吸干净，不要搅动 DNA 沉淀。

9. 在室温下凉干 DNA 沉淀，然后用蒸馏水重新溶解 DNA, 使其终浓度为 lug/ul。

10. 退火使引物 DNA 与变性模板结合，对于四组一套的 DNA 测序反应使用 5ug(5ul)碱变性质粒 DNA(如在含有 ddA 的反应中，变性 DNA 的量为 1.25ug; 在含有ddG 的反应中，变性 DNA 的量为 1.25ug; 依此类推）。设立退火反应如下：

碱变性 DNA                          5.0ug（溶于 5ul 水中）

DMSO(*可选）                     2.0ul

测序蘼反应缓冲液                2.0ul

测序引物                              10.ul(10ug)

水                                         至终体积 11.0ul

*请参见方案 4 的疑难解答。

加热混合物至 65°C,2 min。然后使之缓慢冷却至室温。将退火的样品保存于冰上，直至进行延伸/链终止反应。

11. 接着按方案 3 的步骤 3 进行。