乙醇沉淀法纯化放射性标记的寡核苷酸实验

试剂、试剂盒 乙酸铵乙醇TE放射性标记的寡核苷酸纯化的原料

实验步骤

材料

溶液和缓冲液

稀释贮存液至适当浓度。

乙酸铵（1mol/L)

乙醇

TE(pH7.6)

核酸和寡核苷酸

放射性标记的寡核苷酸

纯化的原料是方案 2(步驟 3 或步骤 5) 的反应混合液，T4 噬菌体多核苷酸激酶巳在 68°C 加热后灭活。

方法

1. 放射性标记的寡核苷酸的管中加入 40ul 水，充分混匀，再加入 240ul 5mol/L 的乙酸铵溶液。再次混匀后，加入用冰预冷的乙醇 750ul, 混匀，于 0°C 放置 30 min。

用乙酸铵代替乙酸钠以确保更有效地除去未掺入的核糖核酸。核糖核酸与脱氧核糖核酸在乙醇乙酸铵溶液中的溶解常数大于乙醇乙酸钠溶液。未掺入的核糖核酸在沉淀反应中被保留在乙醇相。

2.4°C 下以最大转速离心 20 min, 回收放射性标记的寡核苷酸。

3. 用装有一次性吸头的微量移液器小心吸去管中的上清。

警惕：上淸中含有大部分未掺入的 [γ-32P]ATP。磷酸化反应常使用大于 100uCi 的放射性标记 ATP, 因此上淸中放射性剂量相当可观，应小心、谨慎处理未掺入的放射性物质、移液器吸头及微量离心管。

4. 在管中加入 500ul80% 的乙醇，弹动管壁以洗涤核酸沉淀，再次在最大转速下离心 5 min。

5. 用装有一次性吸头的微量移液器小心吸去管中的上清（此时上清中仍含有相当剤量的放射性）。将离心管放置于聚异丁烯酸树脂防护屏后，打开管盖，让剩余的乙醇挥发干净。

6.100ulTE(pH7.6) 溶解放射性标记的寡梭苷酸。

放射性标记的寡核苷酸在-20°C 可以保存数天。但是，保存期延长时，32P 的衰变引起的放射化学损伤会导致寡核苷酸与把序列的结合能力下降。