试剂、试剂盒 封闭缓冲液氯仿IPTG抗原-抗体复合物检测试剂SMTNT 缓冲液洗涤缓冲液放射性碘标记第二抗体第一抗体LB 琼脂板LB 顶层琼脂板硝酸纤维素滤膜λ噬菌体表达文库E.coli
仪器、耗材 预设 42°C 的空气培养箱培养管平头镊子装有防水黑墨水（印度墨水）并带有 18 号针头的注射器
实验步骤
材料
缓冲液
贮存液、缓冲液及试剂的组分请见附录 1, 贮存液稀释至含适浓度。
封闭缓冲液
10mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
150 mmol/L NaCl
0.05%(V/V) Tween-20
20%(V/V) 胎牛血淸
另外，也可用 5%(V/V) 脱脂奶粉或含 1% 明胶 (m/V) 和 3%(m/V) 牛血清白蛋白的 TNT 缓冲液作封闭缓冲液。至于哪种试剂最好，不同实验室各执一辞。建议研究者通过预实验来决定最佳选择。封闭缓冲液于 4°C 保存，可反复使用数次。洧液中加入终浓度为 0.05% 的叠氮化钠抑制微生物的生长。
氯仿
IPTG(10 mmol/L)
步骤 4 前，溶解 0.6 g 固体 IPTG 子 250 ml 水中。通过 0.25um 滤膜灭菌处理。
抗原-抗体复合物检测试剂：
碱性磷酸酶 (AP) 偶联抗体进行生色反应筛选试剂
辣根过氧化物酶（HRP) 偶联抗体进行生色筛选试剂
化学发光筛选试剂
每种筛选方法所用的试剂，请见步骤 15, 关于检测抗体的常用方法，请见本章末信息栏中用抗体进行免疫筛选相关内容。详情请见附录 9。
SM
室温下保存 50 ml 等份 SM. 用后丢弃以免污染。
TNT 缓冲液
10 mmol/LTris-Cl(pH8.0)
150 mmol/LNaCl
0.05%(V/V)Tween-20
每筛选 10 张滤膜需大约 1 升 TNT 缓冲液。室溫保存。
洗洚缓冲液：
含 0.1%(m/V) 牛血淸白蛋白的 TNT 缓冲液
含 0.1%(m/V) 牛血涛白蛋白和 0.1%(V/V)NP-40 的 TNT 缓冲液
这些缓冲液不含叠氮化钠
放射性化合物
125I 标记的蛋白质 A 或 125I 标记的免疫球蛋白（可任选）
放射性碘标记第二抗体
若用步骤 15 中放射性标记第二抗体来检测抗原-抗体复合物时可用此种抗体。
抗体
第一抗体
对于第一第二抗体的选择，参见本章末信息栏利用抗体进行免疫筛选相关内容。
培养基
LB 琼脂板
90mmPetri 平皿中应放有 30~35 ml 琼脂培养基，150 mm 板上则要有约 50 ml。平板必须干燥，否则，当硝酸纤维素滤膜移走时，上层琼脂糖会剥离。通常把两天前铺制的平板稍微打开盖放于 37°C 继续干燥 1~2 h, 效果很好，筛选过程中应使用不含氨苄青霉素的 LB 琼脂平板，因为大肠杆菌 Y1090 hsdR 在抗生素存在下生长缓慢。
LB 顶层琼脂板
将顶层琼脂于微波炉短时间融化，冷却至 47°C, 将其分成 3 ml 等份小样（用于 90 mm 平板）或 7.5 ml 等份小样（用于 150 mm 平板)，置于无菌管中，将这些等份样置于 47°C 干浴或水浴中以防凝固。
专用设备
预设 42°C 的空气培养箱
培养管（无菌 13 mmX100 mm）
平头镊子
装有防水黑墨水（印度墨水）并带有 18 号针头的注射器
硝酸纤维素滤膜
适用于结合蛋白及免疫印记反应的滤膜有不含 Triton-X100 的硝酸纤维素滤膜（Millipore HATF 或相当产品）及硝酸纤维素衍生物如 Hybond-Cextra (Amersham Pharmacia Biotech 公可)，尼龙膜或带极性尼龙膜因为背景较高及固定蛋白质能力弱不适用于免疫筛选。
用软铅笔或圆柱珠笔在滤膜上作好记号，用水打湿，夹于干燥 Whatman3 MM 滤纸之间，用铝箔将一叠滤纸包好，10psi(0.70 kg/cm2) 高压蒸汽灭菌。
附加试剂
本方案步骤 1 需第 2 章方案 1 列出的试剂。
本方案步骤 17 需第 2 章方案 1 列出的试剂。
载体及细菌株
λ噬菌体表达文库
可按第 11 章所述利用合适表达载体构建 cDNA 文库，亦可从供应商处购得，开始实验前，应按第 2 章方案 1 中所述确定噬苗体溶液的效价。
E.coli
采用不同宿主菌株进行筛选则需要不同培养基，例如：E.coli Y1090 hsdR，常可用做 λgtll 构建的 cDNA 文库的宿主菌，它在编码 ATP 依赖性蛋白酶的基因上携带一个突变在这种菌株表达的融合蛋白比在没有这种突变的菌株中更稳定。这种菌株还携带 pMC9 质粒，编码 lac 阻遏蛋白，防止β-半乳糖苷酶启动子启动细胞毒性融合蛋白的合成。9pMC9 质粒还携带选择标志（amp）, 保证不使质粒丢失。E.coli Y1090 hsdR 菌株应在含 50ug/ml 氨苄青霉素的培养基中生长（筛选除外，请见上述关于 LB 琼脂平板的注释）。对于λZAP 及其衍生物构建的文库，则用 E.coli BB4 和 XL1-Blue 菌株进行免疫筛选。此株在 F‘因子上携有 lacl 基因和四环素抗性标记（tet)。这类菌株应在含 12.5ug/ml 四环素的培养基中生长。
在应用这些宿主菌前，应熟悉其基因型及任何特殊的生长要求。
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