实验材料 进行转染的细胞株按第二阶段所介绍的方法制备表达了蛋白质探针的细胞
试剂、试剂盒 N-二羟乙基甘氨酸消化缓冲液NN-二甲基甲酰胺磷酸钠磷酸盐缓冲溶液TE木瓜蛋白酶Cy3 和 Cy5 OSu 单功能硫代吲哚花菁琥珀酰亚胺酯抗体SDS-聚丙烯酰胺凝胶明胶溶液聚-L-赖氨酸质粒 DNAGFP 融合载体CO2-非依赖性成像培养基
仪器、耗材 Centricon 浓缩器色谱柱蛋白 A-琼脂糖凝胶柱可见吸收分光光度计组织培养板玻璃底组织培养皿放大器氩激光宽带绝缘反射镜MCPCCDGFPCy3单面镀银反射镜曲镜座透镜支架标竿后支架倒置显微镜可变光圈透镜水银灯油接物镜光学操作台Power PC水循环冷却装置
实验步骤
第一阶段 用荧光染料标记蛋白质
材料
缓冲液和溶液
将储备溶液稀释到适当的浓度。
用 NaOH 调节的 N-二羟乙基甘氨酸（0.1mol/L,PH7.5)
用 NaOH 调节的 N-二羟乙基甘氨酸（1mol/L,pH9.0~9.5)
消化缓冲液
20 mmol/L 磷酸钠
10 mmol/LEDTA
20 mmol/L 半胱氨酸/HCl 缓冲液（pH7.0)
N,N-二甲基甲酰胺（DMF)
在存储容器中加入约 1/3 体积的吸湿性树脂用于干燥 DMF。例如，可以始终将 AG501-X8 混合床树脂 (Bio-Rad) 放在 DMF 原料瓶中。如果对 DMF 的完整性有任何疑问时，则可以另外加入一些新鲜树脂，或者用新鲜树脂替换老树脂。这样的操作是考虑到会出现标记蛋白质能否达到期望比例的问题，因为标记反应时水的存在（可能来源于 DMF) 会竞争游离染料。
含有 10 mmol/LEDTA(pH7.0) 的磷酸钠（20 mmol/L)
磷酸盐缓冲溶液（PBS)
TE(pH7.0)
酶和缓冲液
固定在琼脂糖顆粒上的木瓜蛋白酶（分散在消化缓冲液中的 50% 混悬液；Sigma)
标记化合物
Cy3 和 Cy5 OSu 单功能硫代吲哚花菁琥珀酰亚胺酯（Amersham)
硫代吲哚花菁（cy) 的琥珀酰亚胺酯染料共价结合到游离氨基（赖氨酸侧链α-氨基末端或 e-氨基）。Cy 染料以冻干态使用，所有情況下保证其处于干燥状态以避免与水反应。由于批与批之间可能存在差异，每一瓶中染料的量必须单独测定。在这里所举的例子中，用俄勒冈绿的琥珀酰亚胺酯（分子探针）来标记 MC5 PKCα抗体。
抗体
待标记的纯化抗体，如 MC5(单克隆）或 T250(多克隆），或蛋白质标记反应必须在没有氨基的缓冲液中进行。许多商用抗体制品中添加了含有可能竞争 Cy 染料的游离氨基添加剂（如牛血清白蛋白或明胶）。也有许多供应商可以根据要求提供不含这些化合物的抗体制品，这种情况下可以要求提供溶于磷酸盐缓冲溶液中、浓度为 lmg/ml 的样品。
凝胶
SDS-聚丙烯酰胺凝胶
制备 SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白时，请参考附录 8
专用装置
Centricon 浓缩器：YM10,YM30,YM100(分别切割 10、30、100kDa 大小的分子；Amicon)
凝胶过滤/分子大小排阻色谱柱（预装一次性 Econo-Pac 10DG;Bio-Rad)
蛋白 A-琼脂糖凝胶柱（Econo-Pac 的 2 ml 柱；Bio-Rad)
用装料体积 20 倍的 20 mmol/L 磷酸钠冲洗柱来使柱平衡。推荐用蛋白 G 来纯化小鼠抗体。
UV/可见吸收分光光度计
附加试剂
本方案中的第 7 步需要测定蛋白质浓度的试剂（如 Bradford 分析试剂）（Spector et al.1998，第 56 章）。
方法
Fab 片段的制备与纯化
1. 采用像 Centricon YM100 的一次性浓缩器，以离心的方法使抗体在含 10 mmol/L EDTA 的 20 mmol/L 磷酸钠溶液（pH7.0) 中的浓度浓缩至 15~20 mg/ml。
2. 向 250ul 浓缩的抗体制品（约 4~5 mg) 中加入 500ul 消化缓冲液和 500ul 固定在琼脂糖顆粒上的 50% 木瓜蛋白酶混悬液（分散在消化缓冲液中）。37°C 振摇（振荡孵化器中，300~400r/min)6~10 h 进行消化。
重要：消化过度（如超过 16 h) 将导致 Fab 片段裂解成较小的多肽。因此建议进行预试验，毎隔1h 取少量的消化液（约 5ul) 采用还原性 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分桁，在还原条件下，lgG 的重链和轻链会像 50kDa 和 25kDa 的多肽一样迁移。经木瓜蛋白酶消化的抗体按约 25kDa 大小的分子迁移。
3. 采用蛋白质 A-琼脂糖凝胶柱从 Fc 部分和未经消化的抗体中纯化 Fab 片段。将消化混合物加到平衡过的柱上，并按每份 1 ml 立即开始收集流过液部分。
蛋白 A 将与抗体的 Fc 部分结合，因此可以从消化混合物中除去全抗体和 Fc 部分，获得的流过液就仅仅含有 Fab 片段。注意！IgG 分子的许多亚类不与蛋白 A 结合。当需要制备小鼠单克隆抗体的 Fab 片段时，使用蛋白 G。
4. 为了鉴定哪些流过液部分中含有纯化的 Fab 片段，测定每一部分的 OD280, 收集并合并 Fab 浓度最高的三个或四个组分。
一般来讲，可以在大约 3~4 个组分中发现 Fab 片段。
5. 使用 Centricon YM100 柱（截流值 10kDa;Amicon) 离心将合并的组分浓缩至体积 0.5 ml 以下。
6. 将样品加到 PBS 平衡的低分子质量（6kDa 以下）凝胶滤过层析柱上，用 PBS 洗脱 Fab 片段（按照产品说明进行)。
为了标记 Fab 片段，必须将它们交换到不含游离氨基（如消化液中必须除去游离半胱氨酸）的缓冲液中。
7. 洗脱后，采用 Centricon 浓缩器使 Fab 片段浓缩后，测定蛋白质浓度。加入 1/10 体积的 1mol/L N-二羟乙基甘氨酸（pH9.0)
采用 Bradford 分析法测定 IgG 浓度，以牛血淸白蛋白作为标准品，并乘以系数 2。
浓缩的 Fab 制品现在就可以准备进行荧光硫代吲哚花菁染料标记。
染料制备
8. 将各瓶冻干染料中的内容物重新混悬于 20ul 的干 N,N-二甲基甲酰胺中，得到浓度约 10 mmol/L 的 Cy 溶液。
9. 将 1ul 染料混合物用 PBS 按 1:10000 稀释，并由可见吸收峰计算染料浓度。
Cy3 和 Cy5 在 554nm 和 650nm 的吸光系数分别为 150000L•nmol-1 和 250000L•nmol-1。
染料结合
10. 标记蛋白质时，将其混悬于不含游离氨基的缓冲液中。如果蛋白质溶液不是在一种适当的缓冲液中，则按上述第 6~7 步进行操作。
蛋白质如果因稳定性的考虑必须采用持定的缓冲系统，则凝胶过滤系统也采用该缓冲液平衡。注意缓冲成分中不应含有游离氨基或抑制标记反应的成分。值得注意的是，像二硫苏糖醇、β-疏基乙醇等还原剂对标记反应有干扰。然而，如果为了保持生理/蛋白质功能而必须添加还原剂时，β-疏基乙醇因为干扰较低，因此是首选的还原剂。在 0.1mol/L N-二羟乙基甘氨酸（PH9.0) 中进行标记以前，T(P)250 和 MC5 均需置换到 PBS 中。
建议在标记反应过程中保持碱性 pH 条作（同时保持蛋白质的完整性），以便使赖氨酸的ε-氨基增加质子解离性并因而能有效地结合。
11. 蛋白质样品（抗体、Fab 片段或蛋白质）与 10~40 倍过量摩尔数的 Cy3 在室温反应 30 min(按第 8~9 步所描述的进行)。将染料非常缓慢地加入到用移液管尖头搅拌的溶液中（小心操作以避免染料直接与微离心管接触)。
为了避免蛋白质因为 DMF 而变性，所加人的 Cy3/DMF 体积必须不超过总体积的 10%。
最佳的过量摩尔数以及反应时间都是根据经验来确定的。标记的目标是能使毎一个蛋白质分子与 1~3 个染料分子结合（对于标记比例标准的讨论，请参阅本方案的导言部分)。对于不同的蛋白质或抗体，其标记水平有很大的变化。如果最终的标记率太低，可能可以重新标记抗体。像 T(p)250 和 MC5 等抗体，已经成功地用超过 40 倍过量摩尔数的染料进行标记。
12. 加入最终浓度为10mmol/L 的含有游离氨基的缓冲液，如 Tris 等来终止标记反应。
13. 采用凝胶过滤柱系统（10DG,Bic-Rad) 来交换缓冲液以除去多余的未反应染料，并将蛋由质洗脱至 PBS 中。
a. 用三倍量填料体积的 PBS 或其他选定的缓冲液（约 30 ml) 平衡柱系统。
b. 为了达到最大分离，将标记反应的混合物直接加到树脂上，并注意使它的体积越小越好。
c. 用 2.5 ml 缓冲液（上空体积约为 3.3 ml) 清洗柱并废弃洗脱液。
d. 另外加入 2 ml 缓冲液并收集可见蛋白质组分，将剩余物丢弃。标记产物将跑在前沿，并可以肉眼观察到，而游离染料从柱上洗脱较慢。
14. 采用 Centricon 浓缩器（可以截流适当大小的分子）再次对标记蛋白质进行浓缩。
15. 采用 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析标记产物，以便验证蛋白质是否成功地被标记。产物经电泳分离后，直接用紫外透照仪（302nm) 检査凝胶上的可见标记产物。
荧光带迁移至蛋白质的预期分于质量部位。在电泳迁移的前沿没有游离染料的荧光；
对于大多数染料，在 302nm 的紫外激发是较好的选择。如果对凝胶照射时不能看到带，则可以考虑采用更短波长的激发光。
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