实验方法原理 与插入型载体不同，置换型载体的基因组含有中部的填充片段，为了容纳外源 DNA 片段，填充片段必须被去除。该过程一般被称为“λ 臂的制备”，包括用限制酶消化 λDNA 使两臂与填充片段分开以及随后的臂的纯化。

实验材料 λ 噬菌体 DNA

试剂、试剂盒 EDTA乙醇正丁醇乙酸钠蔗糖凝胶上样缓冲液TE

仪器、耗材 琼脂糖凝胶Beckman SW28 转子或相当型号透析袋皮下注射用针头宽口吸头蔗糖梯度水浴

实验步骤

一、材料

1. 缓冲液和溶液

EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0)

乙醇

MgCI2 (1 mol/L)

正丁醇

乙酸钠（3 mol/L，pH 5.2)

蔗糖凝胶上样缓冲液

TE ( pH 7.6 和 pH 8.0)

2. 凝胶

琼脂糖凝胶（0.5% 和 0.7%），用 0.5XTBE，含 0.5 μg/ml 溴化乙锭

琼脂糖凝胶（0.5%，75 mm 厚），用 0.5XTBE，含 0.5 μg/ml 溴化乙锭

3. 核酸和寡核苷酸

λ 噬菌体 DNA

4. 离心机和转子

Beckman SW28 转子或相当型号，用清亮离心管，25 x 89 mm ( 如 Beckman SW28 离心管或相当型号）

5. 专用设备

透析袋，煮过（用于 DNA 的透析袋）

皮下注射用针头（21号）

宽口吸头（large-bore tip)

蔗糖梯度（制备两种蔗糖溶液，一种含 10% 蔗糖，另一种含 40% 蔗糖，均溶于含 1 mol/L NaCl、20 mol/L Tris-Cl（pH 8.0）、5 mol/L EDTA（pH 8.0）的缓冲液中。将这两种溶液均通过 0.22 μm 的硝酸纤维素膜以除菌。）

预置于 42℃ 和 68 ℃ 的水浴

二、方法

蔗糖梯度的制备

1. 在清亮的超速离心管中制备一个或多个 38 cm ( 10%~40%，m/V）蔗糖梯度，于 4℃ 静止 1~2 h 直到被使用（步骤 4)。

2. 消化和分析约 60 μg λ 噬菌体 DNA。用标准乙醇沉淀后，将 DNA 溶解于 TE（pH 7.6)，浓度为 150 μg/ml。取一 0.2 μg 的组分留作电泳对照 ( 步骤 7)。

3. 加入 1 mol/L MgCl2 至终浓度 10 mmol/L，42℃ 温育 1 h，使 λ 噬菌体 DNA 的黏性末端复性。然后，取 0.2 μg 的组分经 0.7% 琼脂糖电泳以测定复性是否成功。

4. 对经复性和消化作用的 λ 噬菌体 DNA 来说，它们在每个梯度中的上样量不要超过 75 μg，体积应为 500 μl 或更小。

5. 将梯度于 15℃、120000 g（26000 r/min 于 Beckman SW28 转子中）离心 24 h。

6. 通过用 21 号针头刺穿离心管底收集 0.5 ml 组分。

7. 从收集的样品中每隔两管取两份 15 μl 的样品，加入 35 μl 水。再加入 8 μl 蔗糖凝胶上样缓冲液，其中一份 68℃ 加热 5 min，另一份则不处理。在一块比较厚的 0.5% 琼脂糖凝胶上分析所有样品，并用全长 λ 噬菌体 DNA 和步骤 2 中预留的消化 DNA 组分作分子质量标准。

8. 凝胶照相后，对含复性载体臂的组分进行定位并合并。

9. 将合并的样品置 1000 倍过量的 TE ( pH 8.0) 中，于 4℃ 透析 12~16 h，中间至少更换一次缓冲液。

10. 用正丁醇抽提透析样品数次，使样品体积降低至 3 ml 以下。

11. 用标准的乙醇沉淀回收透析 DNA。

12. 将 DNA 溶解于 TE ( pH 7.6)中，浓度为 300~500 μg/ml。

13. 用分光光度计测定 DNA 的浓度用 0.5% 琼脂糖凝胶电泳确定其纯度。分装成 1~5 μg 的小份，-20℃ 保存。