实验材料 菌落质粒DNA
试剂、试剂盒 CaCl2
仪器、耗材 培养基平板
实验步骤
1. 接种一个单菌落于50 ml LB培养液中，于37°C中速摇床培养过夜（250 r/min)。
2. 往一个2 L的烧瓶中加人400 ml LB培养液，再加入4 ml过夜培养液，于37°C摇床（250 r/min）培养至 OD590为 0. 375。
这一步的目的是使细菌快速生长（对数早期或中期）。
3. 将培养液分装到8个50 ml预冷无菌的聚丙烯管中，于冰上放置5〜10 min。
4. 于4°C，1600 g离心7 min。细胞沉淀用10 ml冰冷的CaCl2溶液重悬。
5. 于4°C，1100 g离心5 min。细胞沉淀用10 ml冰冷的CaCl2溶液重悬，冰上放置30min。
6. 于4°C，1100 g离心5 min。用2 ml冰冷的CaCl2溶液重悬各管细胞。
7. 为了长期保存，按每管250 μl的量分装于预冷的无菌聚丙烯管中，立即冻存于-70 °C。
8. 为检测感受态的效果，按照以下各步骤将10 ng pBR322转化到100 μl感受态细菌。
将合适体积的转化物（1、10和25 μl）涂于含有氨苄青霉素的LB平板上，37 °C培养过夜。
转化的大肠杆菌MC1061和DH1细胞一般可以产生105~108克隆数/μg DNA。
9. 将10 ng DNA (10~25 μl)加人到一个15 ml无菌的圆底试管中，并放置冰上。
10. 将盛有感受态细胞菌的管子握在手上使菌液迅速融化，立即将100 μl感受态细菌加入到管中，轻轻旋动，并放置冰上10 min。
11. 将管放人42°C水浴2 min进行热激，然后加人1 ml LB培养液于每一支试管中，于37 °C置滚筒式摇床（250 r/min)培养1 h。
12. 将几个稀释度菌液涂布于含合适抗生素的平板上，于37 °C培养12~16 h。
对氨苄青霉素来说，最适宜的密度是每个平板上的细胞≤500，这样是为了防止弱抗性的卫星菌落的生长。
13. 短期保存，可以将平板和剩下的含质粒的细菌培养物储存于4°C。长期保存则准备甘油或DMSO存储液，保存于-70°C。取出保存的细胞于选择性平板生长，用酶切检测质粒DNA 。
注意事项
1. 所有与细菌接触的物品和液体都应该是无菌的。
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